western blot原理及操作方法

1、Western blot 原理 分類 主要試劑 操作步驟 常見問題原理 Western Blot（蛋白免疫印跡）采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。抗原一抗生物素標記的二抗ECL發(fā)光試劑

2、分類 SDS-PAGE（十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳） native-PAGE（非變性聚丙烯酰胺凝膠） 區(qū)別在于加不加變性劑（比如SDS）使蛋白質變性，SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質的電泳方式特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量主要試劑1.ddH2O2.30% 丙烯酰胺混合液 丙烯酰胺(arc)29g和N，N-亞甲雙丙烯酰胺(bis)1g加H2O至100ml。儲于棕色瓶，4避光保存。嚴格核實PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。 為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否。主

3、要試劑3. 配膠緩沖液系統(tǒng) 分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCL(pH 8.8) ； 濃縮膠緩沖液：1.0mol/L Tris-HCL (pH 6.8)； 電泳緩沖液： 5XTris甘氨酸緩沖系統(tǒng)， 4保存 5電泳緩沖液（貯存液）的配制： 0.125 M Tris 15.1 g 1.25 M Glycine 94 g 0.5 % SDS 5 g 三蒸水定容至 1000 mL 主要試劑 在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，濃縮膠其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而Cl離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導電性與電場強

4、度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據其固有的帶電性和分子大小進行分離。主要試劑4. 10% 十二烷基硫酸鈉SDS溶液 是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑 去蛋白質電荷； 斷裂分子內和分子間的氫鍵，取消蛋白分子內的疏水作用；使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構，常溫保存。主要試劑5. 10% 過硫酸銨（AP） 催化劑，催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺，4保存，一周內使用 0.1g過硫酸銨溶于

5、1mlddH2O中主要試劑6.四甲基乙二胺TEMED 催凝劑，加速AP催化作用，在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網狀結構主要試劑7. 8SDS-PAGE Loading Buffer溶液（上樣緩沖液） loading buffer的功能主要有兩個： 第一，里邊的指示劑溴酚藍起到指示的作用，它是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置，以便我們適時終止電泳； 第二，里邊的成分甘油可以加大樣品密度，使其沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔。 SDS主要是促使聚合酶變性，因為沒

6、有除盡的聚合酶會結合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。細胞裂解后的裂解液，加loading 100加熱，也是為了中止酶促反應，防止提取的蛋白質降解。主要試劑8.10轉印Buffer（貯存液） 4保存 10轉印Buffer（貯存液）的配制： 0.25 M Tris 30.28 g 1.92 M Glycine 144.13 g 三蒸水定容至 1000 mL 1Transfer Buffer（工作液）： 10Transfer Buffer 100 mL 三蒸水 700 mL 20 % 甲醇 200 mL主要試劑9.甲醇 轉膜液中主要是降低電導的作用，防止轉膜溶液過熱。10.聚偏二氟乙烯(Polyvi

7、nylidene fluoride, PVDF)膜 PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上 的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結合。主要試劑11.三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液Tris buffer saline（1TBS） 洗去Tween,因為Tween會影響發(fā)光 10 mM Tris-HCl （pH=8.0）1 M 10 mL 150 mM NaCl 5 M 30 mL 三蒸水定容至 1000 mL12. Tris buffer saline Tween（ TBST）緩沖液 洗去未結合的抗體 1TBS 1000 mL

8、0.05 % Tween-20 0.5 mL主要試劑13.封閉緩沖液 封閉膜上的非特異性蛋白結合位點，防止一抗、二抗的非特異性反應 TBST Buffer 100 mL 5 % Nonfat Milk 5 g14.一抗15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根過氧化酶） 使試劑中的發(fā)光物氧化并發(fā)光16. ECL檢測試劑操作步驟提取總蛋白蛋白濃度測定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳ECL檢測封閉二抗一抗洗滌洗滌掃描分析轉膜操作步驟1.細胞總蛋白提取及定量2.配膠3.制膠 先用1ml槍頭小心鋪12%分離膠，上加少許ddH2O，待分離膠干凝后，倒去ddH2O ，用濾紙吸干。再鋪8%濃縮膠，注意不要產生氣泡，斜

9、插上梳子，待膠干后備用，拔去梳子。4.上樣 所有上樣孔均加樣，沒有樣本，用上樣緩沖液代替。5.電泳 取40 g蛋白經8%濃縮膠電泳80V 30min，12%分離膠電泳110V 90min。6.轉膜 電泳結束后，切除濃縮膠，按照負極-3張濾紙-分離膠-PVDF濾膜-3張濾紙-正極的順序，組裝電轉膜體系，100V 轉膜25min。操作步驟7.PVDF膜的免疫學檢測 PVDF膜經5%脫脂奶室溫封閉1 h一抗4溫和震蕩過夜TBST洗滌三次HRP標記二抗室溫溫育1 hTBST洗滌三次后，應用化學發(fā)光底物檢測試劑盒進行檢測8.結果分析 以GAPDH為內參照，以靶蛋白/內參照灰度的比值作為蛋白的相對表達含量

10、，進行半定量檢測常見問題1.分離膠濃度 根據目的蛋白分子量選擇膠的濃度 蛋白分子量蛋白分子量 (kDa) 凝膠濃度凝膠濃度 (%) 4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-200 8常見問題2. 在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性,這是為了控制慢離子的解離度,從而控制其有效遷移率.要求在樣品膠和濃縮膠中,慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低,以使樣品夾在快、慢離子界面之間,使樣品濃縮.而在分離膠中慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高,使樣品不再受離子界面的影響.常見問題3. 加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質分子跑時在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。也可以覆蓋一層無水乙醇。常見問題4. 從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜保濕，避免膜的干燥，否則極易產生較高的背景。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路6.電轉移時會產熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫7.切濾紙和膜時，一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜常見問題8.二抗的選擇根據一抗的種屬來源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗體，則二抗應選擇山羊或其他來源抗兔的抗體，而且二抗要標記有同位素或酶。9.條帶兩邊擴散：加樣量