術(shù)前化療對(duì)Ⅲ期NSCLC基因變異的作用及其臨床意義

1、    術(shù)前化療對(duì)期NSCLC基因變異的作用及其臨床 意義        摘要：目的通過檢測(cè)術(shù)前化療與單一手術(shù)組織標(biāo)本之間多種癌基因與抑癌基因分子變異的差異，以期探討術(shù)前化療對(duì)期NSCLC患者基因變異的影響及其臨床意義。方法分別采用DNA印跡法及PCR技術(shù)，檢測(cè)75例期NSCLC組織DNA標(biāo)本中c-myc、c-erbB2及EGFR多種癌基因擴(kuò)增及71例組織中抑癌基因p15的純合性丟失。結(jié)果1)術(shù)前化療組的多種癌基因共擴(kuò)增率為35.5%，而相應(yīng)單一手術(shù)組為63.6%(

2、P0.05)。2)p15的純合性丟失率在術(shù)前化療組為23.3%，較單一手術(shù)組的70.7%有顯著性降低(P0.001)。結(jié)論術(shù)前化療對(duì)期NSCLC患者癌細(xì)胞具有攻擊及殺傷作用，從而不僅使癌基因的共擴(kuò)增率下降，而且也使抑癌基因的丟失率降低。因此檢測(cè)基因的變化在一定程度上有可能作為術(shù)前化療對(duì)于期肺癌治療有效性的實(shí)驗(yàn)室預(yù)測(cè)指標(biāo)。關(guān)鍵詞：肺腫瘤/治療；藥物療法；外科手術(shù)；癌，非小細(xì)胞肺；癌基因；抑癌基因中分類號(hào)：R730.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-7431(2000)05-0385-03THE EFFECT OF PREOPERATIVE CHEMOTHERAPY ON GENES IN P

3、ATIENTS WITH STAGE NSCLC AND ITS CLINICAL IMPLICATIONSGU Ma-lin,ZHANG Hua, LIAO Mei-lin,et al.(Shanghai Cancer Insititute, Shanghai 200032,China)Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of preoperative chemotherapy on the alteration of oncogenes and tumor suppressor genes in locally advanced NSCL

4、C and its clinical significance.MethodsCo-amplification of oncogenes were evaluated by Southern blot and slot blot for 75 patients with stage NSCLC and homozygous deletion of MTS2/p15 gene was determined by PCR(Polymerase chain reaction) for 71 patients. Results1) The rate of co-amplification in sta

5、ge NSCLC patients with chemotherapy was 35.5%, while that in stage NSCLC without chemotherapy was 63.6%. 2) the rate of p15 gene homozygous deletion in group with chemotherapy (23.3%) was dramatically lower than in group without chemotherapy (70.7%,P0.001). ConclusionPreoperative chemotherapy plays

6、an important role in treatment of stage NSCLC patients. By attacking and killing the cancer cells, preoperative chemotherapy not only can lower the rate of oncogenes co-amplification, but also the rate of p15 gene homozygous deletion. Therefore, detection of genes alleration may be used as a potenti

7、al predictor for evaluating preoperative chemnotherapy in treatment of stage NSCLC patients.Key words：Lung neoplasms/treatment;Drug therapy；Surgical operation;Carcinoma,non-small-cell lung;Oncogenes;Tumor suppressor gene隨著環(huán)境的污染以及吸煙人群的增加，導(dǎo)致肺癌的發(fā)病率逐年增高并居上海市所有惡性腫瘤死亡率的首位，從而嚴(yán)重地危害人民的生命健康，因此肺癌的基礎(chǔ)及臨床研究日益受到人們

8、的密切關(guān)注及重視。NSCLC占肺癌80%以上，因此對(duì)于NSCLC的研究就更具有重要的臨床價(jià)值。化學(xué)藥物早已被人們作為治療惡性腫瘤的主要手段之一，然而術(shù)前化療是近幾年剛開展的新綜合治療的一個(gè)組成部分。該治療方法的重要價(jià)值在于使腫瘤原發(fā)灶及其浸潤范圍縮小，為手術(shù)治療創(chuàng)造條件，提高手術(shù)切除率并有利于消除原發(fā)病灶以外的微小病灶，以減少術(shù)后播散及提高生存率，據(jù)報(bào)道NSCLC單一手術(shù)組的死亡危險(xiǎn)是術(shù)前化療組的五倍1，2。林震瓊等3曾從病理形態(tài)學(xué)出發(fā)，分析術(shù)前化療對(duì)NSCLC的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)期NSCLC患者作術(shù)前化療的手術(shù)標(biāo)本約有23.8%可轉(zhuǎn)化為P期(病理分期)，從而提示通過術(shù)前化療可出現(xiàn)組織形態(tài)病理分級(jí)

9、降低的現(xiàn)象，但是否能出現(xiàn)癌基因及抑癌基因的變異至今尚未見報(bào)道。為此，本文擬從分子水平通過檢測(cè)術(shù)前化療組及非化療組NSCLC組織標(biāo)本中多種癌基因(C-myc、C-erbB2及EGFR)活化及p15抑癌基因丟失之間的差異，以期探討術(shù)前化療對(duì)期NSCLC組織中基因的變異及其臨床應(yīng)用意義。材料與方法一、組織標(biāo)本19951998年期間收集經(jīng)病理證實(shí)的75例非小細(xì)胞肺癌新鮮手術(shù)標(biāo)本其中31例患者術(shù)前經(jīng)化療處理，采用MVP方案(絲裂霉素、長春新堿、順鉑)23個(gè)周期。所有患者均屬上海市區(qū)居民并主要來自于上海市胸科醫(yī)院及上海市肺科醫(yī)院。新鮮組織標(biāo)本均在手術(shù)切除后1 h內(nèi)放于液氮內(nèi)深低溫保存，以防組織自溶。二、D

10、NA純化DNA純化步驟基本參照Maniatis氏等分子克隆技術(shù)并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室改良方法。三、基因檢測(cè)步驟采用DNA印跡法(Southern blot及slot blot)檢測(cè)每份非小細(xì)胞肺癌組織DNA中c-myc、c-erbB2及EGFR多種癌基因擴(kuò)增；采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)抑癌基因p15的純合性丟失。四、基因探針及引物癌基因探針均由日本國家癌癥研究所基因庫饋贈(zèng)，其中各類基因探針分子量c-erbB2為3.0 kb，c-myc為8.5 kb，EGFR為2.4 kb。PCR擴(kuò)增時(shí)的引物：p15基因外顯子(Exon 2)及內(nèi)對(duì)照-actin基因的引物均由中科院細(xì)胞生物學(xué)研究所合成。p15基

11、因外顯子2(exon2)引物序列如下：sense 5-TGGCTCTGACCACTCTGC；antisense 5-AGCGAATTCGGGTGGGAAATTGGGGTAAGAA。-actin基因的引物序列如下：sense 5-GAAACTACCTTCAACTCCATC；antisense 5-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGGGCC五、資料統(tǒng)計(jì)處理采用2檢驗(yàn)。結(jié)果一、期NSCLC中多種癌基因的共擴(kuò)增對(duì)75例期NSCLC肺癌組織DNA標(biāo)本采用DNA印跡法并分別以單個(gè)標(biāo)本對(duì)C-myc、C-erbB2及EGFR基因同時(shí)作多基因擴(kuò)增檢測(cè)(Coamplification of

12、 oncogenes)。判斷標(biāo)準(zhǔn)以三種癌基因中至少有兩個(gè)基因擴(kuò)增作為陽性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表1)表明術(shù)前化療后癌基因共擴(kuò)增率為35.5 %，較單一手術(shù)組63.6 %低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。二、期NSCLC與p15基因純合性丟失的相關(guān)性研究經(jīng)采用PCR法并結(jié)合p15基因外顯子2引物，分別對(duì)71例期NSCLC患者作基因純合性丟失檢測(cè)，以期了解p15基因失活在兩組標(biāo)本中的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表2)表明經(jīng)過術(shù)前化療p15基因純合性丟失率有顯著降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 表1兩組期NSCLC多基因共擴(kuò)增分組總例數(shù)c-myc、c-erbB2及EGFR共擴(kuò)增陽性數(shù)陰性數(shù)陽性率(%)術(shù)前化療組31112035

13、.5單一手術(shù)組44271763.6?P0.05 表2兩組NSCLC中p15基因純合性丟失分組總例數(shù)p15基因純合性丟失陽性數(shù)陰性數(shù)陽性率(%)術(shù)前化療組3072323.3單一手術(shù)組41291270.7?P0.001 討論當(dāng)今術(shù)前化療作為綜合治療的一個(gè)重要部分逐漸被人們所接受并成為一種發(fā)展趨勢(shì)，它能使原發(fā)病灶及其浸潤范圍縮小，為手術(shù)治療創(chuàng)造條件，進(jìn)而可對(duì)期腫瘤患者采取包括外科手術(shù)在內(nèi)的多學(xué)科治療，從而能極大地改善患者的預(yù)后。關(guān)于化療后腫瘤組織分子遺傳學(xué)方面的變化也有報(bào)道，包括p53、p21及bcl-2的基因表達(dá)在頭頸癌輔助化療前后的變化等4，5。myc基因產(chǎn)物是一種能與DNA分子結(jié)合的蛋白質(zhì)，它

14、是一種轉(zhuǎn)錄活化因子(transcriptional activator)。在肺癌中myc基因活化的一般機(jī)制是基因擴(kuò)增而導(dǎo)致的過度表達(dá)，一旦myc蛋白增加，可刺激細(xì)胞增生以最終惡變。臨床研究提示，幾乎所有的小細(xì)胞肺癌及大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌組織中均可出現(xiàn)myc基因族中任何一種基因的變異，NSCLC中約有40%50%出現(xiàn)c-myc基因的基因擴(kuò)增及高表達(dá)，這類患者預(yù)后差，生存期短6。c-erbB-2與EGFR均屬于表皮細(xì)胞生長因子受體，這類基因的過度表達(dá)在某些人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤的惡性程度及癌癥患者低生存率之間存在密切的相關(guān)性。文獻(xiàn)報(bào)道腺癌中有83%出現(xiàn)上述基因的共擴(kuò)增并與病人的不良預(yù)后有關(guān)7。

15、本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)62例非小細(xì)胞肺癌新鮮組織標(biāo)本進(jìn)行c-myc、c-erbB2及EGFR三種基因擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果提示多種基因的共擴(kuò)增率與病理分期呈正相關(guān)(P0.05)8。為此本文也采用上述方法檢測(cè)及分析經(jīng)術(shù)前化療或未化療的期NSCLC手術(shù)標(biāo)本之間的分子變異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明術(shù)前化療后癌基因共擴(kuò)增率為35.5%，較未化療組63.6%明顯降低并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這一結(jié)果充分說明術(shù)前化療對(duì)期NSCLC患者的癌細(xì)胞具有攻擊及殺傷作用，因此有效地降低了癌基因的共擴(kuò)增率。1994年以來，p16、p15基因分別從人類染色體9p21-22區(qū)處分離及純化，并發(fā)現(xiàn)該基因?qū)貱DK4和CDK6(cyclin-depen

16、dent kinase)的抑制因子，稱為MTS1及MTS2。其基因表達(dá)產(chǎn)物可與CDK4-cyclin D復(fù)合物結(jié)合，使CDK4激活功能喪失，阻滯細(xì)胞進(jìn)入G1/S期，抑制細(xì)胞過度生長。一旦p16，p15基因丟失或突變，失去對(duì)CDK功能的抑制從而促使細(xì)胞無限制地進(jìn)入G1/S期并加快細(xì)胞分裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞永生化而形成腫瘤細(xì)胞。Washimi等9證實(shí)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株及原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌組織均可出現(xiàn)p15及p16基因的純合性共丟失現(xiàn)象。本文采用PCR技術(shù)通過檢測(cè)p15基因純合性丟失比較研究術(shù)前化療及單一手術(shù)在期NSCLC中基因丟失情況，結(jié)果表明經(jīng)過術(shù)前化療p15基因純合性丟失率由未化療時(shí)的70.7%降

17、為23.3%。由此可見，本文進(jìn)一步從分子水平證實(shí)了術(shù)前化療具有促使某些中晚期肺癌患者組織形態(tài)學(xué)惡性程度下降的作用。上述結(jié)果充分表明，術(shù)前化療對(duì)期NSCLC患者癌基因及抑癌基因的變異具有明顯的作用。通過術(shù)前化療殺傷癌細(xì)胞，既能使癌基因的共擴(kuò)增率明顯下降，又能導(dǎo)致抑癌基因的純合性丟失率降低，因此有可能從分子水平上阻滯腫瘤細(xì)胞發(fā)展進(jìn)程10。更為重要的是根據(jù)本文的初步結(jié)果可提示分子生物學(xué)研究有可能為期NSCLC患者采用術(shù)前化學(xué)藥物治療在臨床上的有效性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。至于對(duì)某些經(jīng)術(shù)前化療而導(dǎo)致分子生物學(xué)行為改變的期NSCLC患者的預(yù)后療效及生存率還有待于今后隨訪追蹤。(本文編輯：馬積慶)作者簡(jiǎn)介：顧馬林，

18、男，大專，助理研究員。顧馬林（上海市腫瘤研究怕上海 200032）張華（上海市腫瘤研究怕上海 200032）廖美琳（上海市胸科醫(yī)院）趙明（上海市腫瘤研究怕上海 200032）周瑾（上海市腫瘤研究怕上海 200032）許凱黎（上海市腫瘤研究怕上海 200032）參考文獻(xiàn)1Rosell R, Comez-Codina J, Camps C, et al. A randomized rtrial comparing pre-operative chemotherapy plus surgery with surgery alone in patients with non-small cell lu

19、ng cancerJ. N Engl J Med,1994,330:1532Roth J, Fossella F, Komaki R, etal. A randomized trial comparing pre-operative chemotherapy and surgery with surgery alone in resectable stage A non-small cell lung cancerJ. J Natl Cancer Inst,1994,86:6733林震瓊.肺癌治療后的病理形態(tài)學(xué)M.見：廖美琳主編.肺癌現(xiàn)代治療M.第1版，上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1998：15

20、34Cabelguence A, Blons H, de Wazier I, et al. p53alterations predict tumor response to neoadjuvant chemotherapy in head and neck squamous cell carcinoma:a prospective seriesJ. J Clin Oncol,2000,18(7):14655Ashktorab H, Larbi D, Schwartz J, et al. Expression of p53, p21 and bcl-2 before and after trimetrexate based neoadjuvant chemotherapy for head and neck cancerC.The