探討復方丹參注射液對氧化所致?lián)p傷的血管內皮細胞的保護作用

1、探討復方丹參注射液對氧化所致?lián)p傷的血管內皮細胞的保護作用    【關鍵詞】  復方丹參注射液；,血管內皮；,掃描電鏡摘要：目的探討復方丹參注射液對氧化所致?lián)p傷的血管內皮細胞的保護作用。方法采用臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein cells)，用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察各組內皮細胞（endothelial cell, EC）的形態(tài)學特點。分光光度計測定細胞上清液中丙二醛的含量。結果掃描電鏡觀察顯示過氧化氫組EC皺縮變小，細胞表面干裂，表面微絨毛減少甚至消失，細胞間隙增寬，而經丹參預處理過的過氧化氫組細胞形態(tài)結構則明顯

2、改善。MDA含量測定表明過氧化氫組的MDA含量明顯增高。相反，正常組和丹參組中MDA含量減少（P<0.01）。結論 復方丹參注射液通過其抗氧化作用，對氧化所引起的受損血管EC有保護作用。關鍵詞：復方丹參注射液；  血管內皮；  掃描電鏡    心血管疾病是人類死亡的首要原因。在各種心腦血管疾病中，很多都是由動脈粥樣硬化（atherosclerosis, AS）而引起。而許多研究表明血管內皮細胞（endothelial cell, EC）損傷是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)1。因此保護血管內皮對防治AS具有重要意義。 本實驗通過掃描電鏡觀察細胞的超微結

3、構，用分光光度法檢測MDA含量,以探討丹參對受損傷的血管EC的保護作用，以及其抗AS的作用機理。1  材料與方法1.1  藥物與試劑復方丹參注射液（含丹參1 g/ml）為上海中西藥液股份有限公司產品，批號021001；M199培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產品；胎牛血清為美國HYCOLONE公司產品；MDA試劑盒為北京邦定公司提供；掃描電鏡為日本產品。1.2  人臍靜脈內皮細胞培養(yǎng)按Jaffe等2,3人的方法略加修改進行。在無菌條件下，取健康產婦的臍帶， 灌注0.1%型膠原酶（collagenase-）10 15 ml，置37水浴中孵育1520 min。1 000 r

4、/min離心10 min，沉淀中加入含有20FBS的完全M199培養(yǎng)液5 ml，充分混合制成細胞懸液，以（1.52.0）×104/cm2密度植入培養(yǎng)瓶中，置37，5的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，待細胞長成融合狀態(tài)后進行鑒定及進行實驗。1.3  實驗分組及藥物處理實驗分為3個組：正常組：加入含20FBS的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；H2O2組：首先加入含20 FBS的完全培養(yǎng)液，待細胞基本融合時再加入終濃度為75 mol/L的H2O2刺激4 h；丹參組：加入含20 FBS的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，再加入終濃度分別為0.125，0.25 ，1.25 ， 2.5 mg/ml 和12.5

5、 mg/ml的復方丹參注射液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再加入終濃度為75mol/L的H2O2刺激4 h。1.4  用倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞生長情況選用生長良好的HUVEC，制成細胞懸液接種于預置蓋玻片的24孔板中，每孔加入（12）×105個HUVEC，放置于37，5的 CO2培養(yǎng)箱內，含20FBS的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng)。待細胞生長呈亞融合狀態(tài)后 各組按上述方法處理。取出玻片，放入3戊二醛固定1 h，PBS洗3次，1鋨酸固定，PBS洗3次，梯度酒精脫水，用CO2臨界點儀進行干燥，用離子濺射儀噴金，日立S3500N掃描電鏡觀察。1.5   丙二醛（MDA

6、）含量測定選用生長良好的HUVEC，制成細胞懸液，以濃度（12）×105/ml接種于24孔培養(yǎng)板。每組8個孔，設置7個組。細胞處理同上，終止培養(yǎng)并分別收集所有孔的上清液1 ml，置于20冰箱待測，然后按照北京邦定生物技術有限公司提供的試劑盒說明，用分光光度計檢測MDA含量。1.6  統(tǒng)計學處理所有實驗數(shù)據用Excel統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)值均以±s表示,組間比較用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。2  結果2.1  內皮細胞形態(tài)學觀察在倒置相差顯微鏡下觀察，正常組EC生長旺盛，呈上皮樣貼壁生長，細胞呈多角形或長梭形，呈鵝卵石樣鋪滿底層。在75 mol

7、/L的 H2O2作用4 h后，細胞間隙增大，胞體變小，細胞收縮變圓，失去細胞間連接，胞漿透明，少數(shù)細胞懸浮脫落；隨著作用時間進一步延長，胞膜邊緣不清楚，部分胞膜不完整，細胞出現(xiàn)空泡和顆粒變性，細胞脫落增多，到將近4 h的時候出現(xiàn)拉網現(xiàn)象。而經丹參預處理過的H2O2組EC形態(tài)與正常組相似，并且濃度越高越接近正常細胞組。掃描電鏡可以觀察到正常組(圖1)EC呈圓形或梭形、多角形，表面微絨毛豐富，排列規(guī)則，有光澤，細胞膜完整，細胞間隙較小，細胞連接可見。H2O2組(圖2)的EC皺縮變小，細胞表面干裂，胞膜表面有孔隙，有的呈現(xiàn)不規(guī)則鋸齒狀，表面微絨毛減少甚至消失，細胞間隙增大，微絨毛僵直斷裂，分布不規(guī)則

8、，減少甚至消失，可見微絨毛水腫。而丹參組(圖3)的EC形態(tài)結構則明顯改善，其形態(tài)、大小及微絨毛數(shù)量、分布與正常組相似。圖1  正常組EC（Bar=15m）(略)            圖2   H2O2組EC（Bar=6m）(略)            圖3  丹參組EC(Bar=30m)(略)2.2  各組細胞培養(yǎng)液中MDA的

9、檢測結果用H2O2 刺激細胞后，細胞培養(yǎng)液中的MDA含量明顯升高，而用復方丹參預處理的細胞培養(yǎng)液中的MDA含量與正常組相似。H2O2組與正常組和丹參組比較具有顯著性差異（P<0.01）。結果見表1。表1  各組內皮細胞中丙二醛含量的比較(略)與H2O2組作比較，*P <0.01，n=8 3  討論動脈粥樣硬化是引起各種心血管疾病的主要原因。引起動脈粥樣硬化的因素很多，其中“炎癥-反應”學說4是最受人們關注的。 研究表明5體內許多因素可損傷VEC，以活性氧最重要?；钚匝醭苁筕EC膜脂質、蛋白質、核酸等氧化破壞外，并可氧化修飾低密度脂蛋白，進而更加促進AS的發(fā)展。

10、文獻中提出6H2O2是活性氧，可促進自由基生成。生物體內過氧化氫如不及時被過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶消除，它可通過細胞膜，在膜外與Fe2或Cu2生成羥自由基OHo，從而引發(fā)脂類過氧化而導致細胞損傷。本實驗的掃描電鏡觀察結果顯示H2O2組內皮細胞明顯受損，細胞明顯腫脹及微絨毛消失等超微結構上的變化。而丹參組 的內皮細胞在超微結構上無明顯變化，與正常組相似。表明丹參對受損傷VEC具有保護作用。生化學檢測MDA含量常常反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。脂質過氧化作用不僅把活性氧轉化成活性化學劑，而通過鏈式或鏈式支鏈反應，放大活性氧的作用。因此初始的一個活性氧能導致很多脂類分

11、解產物的形成，這些分解產物中的一些能引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡。中醫(yī)理論認為，丹參具有活血化淤、調經止痛、養(yǎng)血安神、涼血消腫等功能，而且有關丹參的抗氧化作用已經得到人們的重視。徐東坡等7人研究結果表明，丹參對氧自由基清除酶SOD的保護作用優(yōu)于亞硝酸鈉。實驗結果與許晶蘭等8人做的實驗結果基本相符。本實驗發(fā)現(xiàn)H2O2使VECs的脂質過氧化產物增加，而預先加入丹參可減輕VECs的氧化損傷, 細胞損傷不明顯。丹參可能通過清除氧自由基的作用穩(wěn)定細胞膜結構，從而減輕H2O2的氧化損傷作用。總之， 本研究結果表明復方丹參注射液具有保護由過氧化氫所致?lián)p傷的血管EC的作用，從而起到抗AS的目的，其機理可能

12、與丹參抗脂質過氧化作用有關。參考文獻：1   Ross.The pathogenesis of atherosclerosis-anupclateJ.N Eng J Med, Feb 20 1986,314:488.2  Basavaraju SR,Jones TD.Atherosclerosis risks from  chemicals:part 1.toxicological observations and mechanisms of atherosclerosisJ.Arch Environ Contam Toxicol, 1998,35：152.3  何作云.提高冠心病的防治水平，重視血管內皮功能損傷的研究J.中國血液流變學雜志，2002，12（3）：161.4   Ross R, Atherosclerosis -an inflammatory diseaseJ. N  Engl  J med. 1999, 340 (2):115.5  任德成.綜 述血管內皮細胞的氧化性損傷機理J.心血管病學進展，2002，23（4）：235.6  林  蓉，劉俊