超抗原SEB活化耐受性NKT細(xì)胞亞群的研究

1、超抗原SEB活化耐受性NKT細(xì)胞亞群的研究 11-01-30 11:29:00 編輯：studa20 作者：陳鈺, 鐘江 徐健, 陳中才, 郭業(yè)磊, 金婷, 張繼慧【摘要】 目的: 探討超抗原SEB活化的效應(yīng)細(xì)胞參與免疫耐受的NKT細(xì)胞亞群及分化特征。方法: 采用C57BL/J小鼠脾細(xì)胞經(jīng)SEB誘導(dǎo), 收集體外擴(kuò)增10 d的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞, 與刀豆蛋白（ConA）、 脂多糖（LPS）和白介素2（IL2）共同培養(yǎng)3 d, 測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞對(duì)刺激劑的應(yīng)答反應(yīng)能力。在正常小鼠淋巴細(xì)胞與上述刺激劑反應(yīng)的同時(shí)添加效應(yīng)細(xì)胞, 3 d后測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞抑制正常淋巴細(xì)胞對(duì)刺激原的應(yīng)答反應(yīng)能力。用MTT染色方法記錄

2、細(xì)胞增殖的A值。以ConA活化的淋巴細(xì)胞做參照, 用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)解析了耐受性效應(yīng)細(xì)胞中NKT細(xì)胞亞群并顯示分化來(lái)源與功能的相關(guān)性。結(jié)果: 與正常淋巴細(xì)胞對(duì)抗原應(yīng)答反應(yīng)能力相比, SEB活化的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)ConA、 LPS和IL2【關(guān)鍵詞】 NKT細(xì)胞亞群; 超抗原; SEB; 免疫耐受 NKT細(xì)胞是以NK細(xì)胞和T細(xì)胞兩者為特征的, 僅占淋巴細(xì)胞群的1%1。NKT細(xì)胞的作用主要有兩個(gè)方面, 效應(yīng)功能和調(diào)節(jié)功能。它可以抑制Th1細(xì)胞的過(guò)激, 控制IL2, IFN的產(chǎn)生和后期的細(xì)胞增殖, 可以調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生, 使T細(xì)胞分化朝Th2方向偏移; 它也可以在Th1細(xì)胞抵抗感染和腫瘤時(shí)提

3、供幫助以及可以阻止部分細(xì)胞的分化, 控制自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展2。越來(lái)越多的研究報(bào)道了NKT細(xì)胞有很多亞群3, 4, 但是仍不能區(qū)別不同亞群的不同功能以及它們的來(lái)源和分化途徑。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B（Staphylococcal enterotoxin B, SEB）能誘導(dǎo)外周淋巴細(xì)胞生成效應(yīng)細(xì)胞, 這些效應(yīng)細(xì)胞具有明顯的抗排斥作用和免疫耐受特征, 并且均伴隨NKT細(xì)胞的增加5, 6。本研究用超抗原SEB在體外擴(kuò)增了具有耐受功能的效應(yīng)細(xì)胞, 對(duì)這些細(xì)胞的耐受調(diào)節(jié)特征、 細(xì)胞亞群以及在外周淋巴系統(tǒng)生成的NKT細(xì)胞的分化途徑進(jìn)行了研究。 1 材料和方法 1.1 材料 C57

4、BL/J小鼠（雌性, 質(zhì)量1820 g, 68周齡）來(lái)自解放軍第301醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心二級(jí)動(dòng)物房。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司, MTT染料（四甲基偶氮唑鹽3（4.5dimethyiazolzyl）2.5diphenyl tetrazolium bromide）、 ConA和LPS均購(gòu)自Sigma公司, 二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Solarbio 公司, 胎牛血清購(gòu)自北京軍區(qū)獸醫(yī)防治中心, IL2由解放軍302醫(yī)院病毒研究所惠贈(zèng); SEB（自主知識(shí)產(chǎn)權(quán), 專利號(hào): 00103991.4）; 抗CD3PerCP、 CD4FITC、 CD8PE、 NK1.1APC和抗TcRV8PE熒光

5、抗體均購(gòu)自BD公司。 12 方法 121 正常小鼠淋巴細(xì)胞制備 摘取C57BL/J小鼠脾細(xì)胞在無(wú)菌臺(tái)前分離細(xì)胞, 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液, 經(jīng)紅細(xì)胞裂解, 洗滌2次后, 制備成密度為5109/L個(gè)細(xì)胞的懸浮液待用。 122 SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞制備 在25 mL培養(yǎng)瓶中加入1109細(xì)胞/L, 隨后加入3.5 mL 400 g/L SEB混合后置37、 50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)5 d。洗滌換液后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)到第10天, 收獲細(xì)胞, 作為耐受細(xì)胞懸浮至5109細(xì)胞/L用于抑制功能實(shí)驗(yàn)。 123 SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞對(duì)刺激劑的應(yīng)答反應(yīng) 在9

6、6孔板中加入5105細(xì)胞/(100 L/孔), 并分別加入0.1 mL ConA(10 mg/L), 0.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）, 對(duì)照組加入培養(yǎng)液。在37、 50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)3 d后MTT染色, 570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)胞增殖的A值。 124 SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞抑制功能的測(cè)定 在96孔板中加入正常C57BL/J小鼠脾細(xì)胞5105細(xì)胞/（100 L/孔）, 并在分別加入0.1 mL ConA(10 mg/L), 0.1 mL LPS(10 mg/L)和0.1 mL IL2（200 IU/mL）的同時(shí)加入SEB活化的效

7、應(yīng)細(xì)胞5105細(xì)胞/（100 L/孔）。對(duì)照組為正常淋巴細(xì)胞分別加入上述相應(yīng)刺激原。在37、 50 mL/L CO2孵箱培養(yǎng)3 d后MTT染色, 570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定細(xì)胞增殖的A值。 125 SEB活化耐受性效應(yīng)細(xì)胞的T細(xì)胞和NKT細(xì)胞亞群解析 實(shí)驗(yàn)分為SEB和ConA兩個(gè)組。在96孔板中加入5105細(xì)胞/（100 L/孔）, 并分別加入0.1 mL SEB(400 g/L)和0.1 mL ConA(10 mg/L), 在37、 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。取培養(yǎng)第10天的細(xì)胞經(jīng)抗CD3PerCP、 CD4FITC、 CD8PE和NK1.1APC以及CD3PerCP、 CD4FITC、

8、 NK1.1APC和TcRV8PE熒光抗體四染色后, 用流式細(xì)胞儀（FACs Calibue BD, USA）測(cè)定T細(xì)胞、 NKT細(xì)胞亞群增殖的百分?jǐn)?shù)并記錄NKT細(xì)胞亞群分化途徑。 126 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料用xs表示。采用t檢驗(yàn)分析。所有數(shù)據(jù)均用CHISS統(tǒng)計(jì)軟件處理。 2 結(jié)果 圖1 SEB 活化的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)刺激劑的應(yīng)答反應(yīng) Fig 1 The response of the effecter cells by SEBactivated to several mitogens eff.cells: The effector cells by SEBactivated. bP0.01 vs

9、 control group. 23 SEB或ConA活化T淋巴細(xì)胞亞群的比較 在SEB活化的具有耐受功能的效應(yīng)細(xì)胞中CD3+、 CD4+ T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)分別由原始的27.52%和15.04%下降至18.74%和12.35%(P0.05）, TcRV8+T細(xì)胞從10.55%上升到28.48%（P0.01, n=4）。ConA活化的淋巴細(xì)胞主要是T淋巴細(xì)胞, 包括CD3+、 CD4+、 CD8+和TcRV 8+T細(xì)胞亞群。它們分別由最初的27.52%、 15.04%、 16.11%和10.55%上升到41.72%、 36.49%、 54.21%及25.86%（P0.01, n=4, 表1)。表

10、1 SEB或ConA活化的T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù) 24 SEB和ConA活化的NKT細(xì)胞亞群的比較 在SEB活化的耐受性效應(yīng)細(xì)胞中, 明顯增殖的細(xì)胞是CD4+ NK1.1+、 CD8+ NK1.1+ 和TcRV8+ NK1.1+ 的NKT細(xì)胞亞群, 它們分別由原始的0.86%、 1.72%和0.92 %上升至9.53%、 7.02%和3.34%(P0.05, P0.01, n=4); CD4-CD8-CD3+ NK1.1+NKT細(xì)胞沒(méi)有顯著性增加。相反ConA活化了CD4-CD8-CD3+ NK1.1+NKT細(xì)胞, 使這群細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)由原始的1.51%上升至2.81%（P0.05, n=4）, 但不能誘導(dǎo)其他NKT細(xì)胞亞群活化增殖（表2）。表2 SEB或ConA活化的T細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù) 25