實驗1細胞融合實驗及觀察實驗2紅細胞膜滲透性觀察

1、 實驗1: 細胞融合實驗及觀察 實驗2: 紅細胞膜滲透性觀察實驗十實驗十 細胞融合與血紅細胞滲透性的觀察細胞融合與血紅細胞滲透性的觀察實驗實驗1 1 細胞融合操作與觀察細胞融合操作與觀察 細胞融合（cell fusion）又稱細胞雜交（cell hybridization），是指在自然條件或利用人工（生物的、物理的、化學(xué)的）方法，使兩個或兩個以上的細胞融合成一個具有雙核或多核細胞的現(xiàn)象。此雜交細胞具有很強的生命力，增殖旺盛。 細胞融合術(shù)是細胞遺傳學(xué)、細胞免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)等研究的一重要手段，也是制備單克隆抗體雜交瘤細胞株的重要技術(shù)。 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康牧私饧毎诤系脑?、意義；了解細

2、胞融合的方式；初步掌握聚乙二醇法誘導(dǎo)細胞融合的實驗方法。 在誘導(dǎo)物（如仙臺病毒，聚乙二醇）作用下，細胞發(fā)生凝集，隨后在質(zhì)膜接觸處發(fā)生質(zhì)膜成份的一系列變化，主要是某些化學(xué)鍵的斷裂與重排，最后打通兩質(zhì)膜，形成雙核或多核細胞（此時稱同核體或異核體）。二、細胞融合基本原理二、細胞融合基本原理同核體 同一個體（基因型相同）的親本細胞異核體 不同個體（基因型不同）的親本細胞細胞融合的意義細胞融合的意義 我們知道，無論是遠緣雜交還是利用多倍體技術(shù)都要先實現(xiàn)有性雜交，而親緣關(guān)系較遠的物種間雜交往往表現(xiàn)為雜交不親和或不能受精或是胚胎早期敗育?？朔h緣雜交中的不親和障礙；優(yōu)良性狀改良；組合起各種植物的優(yōu)良遺傳性狀

3、，從而培育出理想的新品種。進行體細胞融合就可以避開生殖細胞的受精過程。在親緣關(guān)系更遠的物種間實現(xiàn)建基因轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造出自然界沒有的新物種。馬鈴薯和番茄通過細胞融合得到了至今有性雜交未能獲得的屬間雜種薯番茄和番茄薯；白菜和甘藍通過細胞融合得到白菜甘藍。實例實例細胞融合方式細胞融合方式 自發(fā)產(chǎn)生 人工誘導(dǎo)產(chǎn)生 生物法：滅活的病毒 化學(xué)法：聚乙二醇(PEG） 物理法: 電融合n 很多種類的病毒能介導(dǎo)細胞融合,如仙臺病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒、牛痘病毒等，其中仙臺病毒最常用。這類病毒的被膜中有融合蛋白，可介導(dǎo)病毒與宿主細胞融合，也可介導(dǎo)細胞與細胞融合。用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或-丙內(nèi)酯滅活，使病

4、毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。n 優(yōu)點：融合率較高，對各種動物細胞都適宜，且仙臺病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)。n 缺點：病毒不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會降低，并且制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進細胞后，可能會對細胞的生命活動產(chǎn)生干擾。方式一：病毒誘導(dǎo)融合方式一：病毒誘導(dǎo)融合方式二：化學(xué)誘導(dǎo)融合方式二：化學(xué)誘導(dǎo)融合 n 很多化學(xué)試劑能夠誘導(dǎo)細胞融合，如聚乙二醇（PEG）、 二甲亞砜、甘油、山梨醇等。n 這類物質(zhì)導(dǎo)致細胞膜脂分子排列的改變，在去除作用因 素之后，質(zhì)膜恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)，在恢復(fù)過程中由于 接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親合和表面張力，使相接觸 的細胞發(fā)生融合。n 優(yōu)缺點：使用

5、起來很方便，誘導(dǎo)細胞融合的頻率比較 高，但是它有一定毒性，對有些細胞（如卵細胞）不 適用。n 20世紀(jì)80年代建立起來的電融合技術(shù)，是將兩種細胞的混合液置于低壓交流電場中，細胞極化成偶極子，排列成串珠狀，然后施加瞬間強脈沖，使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，從而導(dǎo)致融合。n 具有融合的頻率高，具有對細胞無毒害作用、操作簡便、作用機制明確、可重復(fù)性好等優(yōu)點，但難以控制一對細胞的融合。 方式三：電融合方式三：電融合電融合儀聚乙二醇法的原理聚乙二醇法的原理聚乙二醇 (Polyethylene glycol，PEG) ：化學(xué)結(jié)構(gòu)HO(CH2CH2O)nH ，無色無臭粘稠液體至蠟狀固體，溶于水、乙醇和許多其它有機

6、溶劑，具有良好的水溶性，無毒、無刺激性。原理：PEG分子能改變各類細胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親合以及彼此的表面張力作用，使細胞發(fā)生融合。優(yōu)點：成本低、異核率高、不受物種限制。影響融合率的因素影響融合率的因素 分子量分子量大，促融合能力越高； 濃度濃度越低，越易操作，毒性越低； 融合時間30 s120 s； pH值一般以稍堿性為宜（7.4-8.0）。 兼顧融合率、PEG毒性和黏度，通常選用相對分子質(zhì)量10004000，濃度在30%50%的PEG。 三、細胞融合的應(yīng)用三、細胞融合的應(yīng)用微生物原生質(zhì)體融合構(gòu)建新菌株植物原生質(zhì)體融合和

7、培養(yǎng)技術(shù)培育新植物（薯番茄/番茄薯）動物細胞融合用于研究核質(zhì)關(guān)系、繪制染色體基因圖譜、制備單克隆抗體、研究腫瘤發(fā)生機制等領(lǐng)域。1. 器具: 顯微鏡、離心機、離心管、細滴管、載片、蓋片2. 試劑: Alsever液：葡萄糖2.05 g，檸檬酸鈉0.8 g，NaCl 0.42 g，加重蒸水至100 mL。GKN 液：NaCl 8 g，KCl 0.4 g，Na2HPO4.2H2O 1.77 g，NaH2PO4.2H2O 0.69 g，葡萄糖2 g，酚紅0.01 g，溶于1 L重蒸水中。0.85% NaCl液 50%聚乙二醇(PEG)：稱取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度試管，在酒精燈火或沸水

8、中加熱溶化。待冷至50時，加入等體積并預(yù)熱至50的GKN液混勻。四、實驗用品四、實驗用品五、實驗內(nèi)容及方法五、實驗內(nèi)容及方法1.用注射器取2 mL Alsever液，再從翼下靜脈取鴨血2 mL，注入管內(nèi)，再加6 mL Alsever液，混勻后置4冰箱中備用。2.實驗時取“步驟1”液1 mL于離心管中，加入4 mL 0.85%的NaCl液，混勻平衡后，以1200 rpm/min離心5分鐘。3.棄上清液。再重復(fù)“步驟2”兩次，最后一次離心10分鐘。4.在沉降血球中加入1 mL GKN液，混勻使之成為細胞懸液。5.用40 m濾膜過濾細胞懸液。6.取0.1 mL“5”液于1.5 mL離心管中，用于對照

9、；剩余“5”液于另一1.5 mL離心管中，加入6-8滴（約0.5 mL）50%的PEG液，迅速混勻，常溫下2-3 min滴片鏡檢。 在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的鴨血細胞膜融合在一起，形成一個融合細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的鴨血細胞。六、結(jié)果觀察與分析六、結(jié)果觀察與分析融合率的計算融合率的計算作業(yè)：描述顯微鏡下細胞融合的變化，計算融合率。 在高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞(包括融合的與未融合的細胞)，融合細胞(含兩個或兩個以上的細胞核的細胞)的細胞核數(shù)除以總細胞核數(shù)(包括融合與未融合的細胞核)即得出融合率。 細胞膜是細胞與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的結(jié)構(gòu)，它可選擇性地讓某些物質(zhì)進出細胞。而對

10、于不同性質(zhì)的物質(zhì)，細胞膜的通透性是大不一樣的。當(dāng)細胞與所處的環(huán)境存在滲透壓差別時，水分子可從滲透壓低的一側(cè)向高的一側(cè)擴散，以至于在高滲環(huán)境中，細胞會失水而皺縮；而在低滲環(huán)境中，細胞會吸水膨脹直至破裂。實驗實驗2 2、紅細胞膜滲透性觀察、紅細胞膜滲透性觀察一、實驗原理一、實驗原理二、實驗器械及試劑二、實驗器械及試劑顯微鏡，燒杯，試管，載玻片，蓋玻片，兔血，1.5% NaCl溶液，蒸餾水等。三、三、實驗步驟實驗步驟(一)兔紅細胞滲透壓的觀察1.取一小燒杯，用肝素液（1 mg/mL生理鹽水）濕潤，然后加入兔血，以10倍生理鹽水稀釋，制成兔血細胞懸浮液.2.取5支試管，編碼后依次向各試管加入1.5% NaCl溶液5, 3, 2, 1, 0 mL,然后分別加入蒸餾水，使每管總體積達到5 mL，配成一濃度梯度的NaCl溶液。3.向每一試管加入0.5 mL兔紅細胞懸浮液，混勻。試管編號試管編號實驗項目實驗項目1.5% NaCl1.5% NaCl（mlml） 5 3 2 1 05 3 2 1