血小板源生長因子對培養(yǎng)內(nèi)皮細胞移行的影響及其與血管內(nèi)皮細胞生長因子的關(guān)系

1、    血小板源生長因子對培養(yǎng)內(nèi)皮細胞移行的影響及其 與血管內(nèi)皮細胞生長因子的關(guān)系        一、材料與方法 1.材料與試劑：人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）株（ECV304）由武漢大學菌種保存中心提供。PDGF-BB、DMEM/F12、胎牛血清(FBS)及青霉素-鏈霉素均為美國Gibco公司產(chǎn)品。血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)抗血清為Santa Cruz公司產(chǎn)品。PDGF-BB、SABC試劑盒抗血清及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)由博士德公司提供。2.血小板源生長因子

2、（PDGF）對培養(yǎng)HUVEC移行的影響：參照Gajdusek等1介紹的方法，并加以改進。選用生長良好的HUVEC懸液，調(diào)整細胞密度為2×104個/ml，接種于6孔培養(yǎng)板,其中放置一大小為0.2 cm×1.0 cm的蓋玻片，加入生長培養(yǎng)液(90% DMEM/F1210 FBS)，37，5 CO2培養(yǎng)至融合狀態(tài)(接種后24 h)，維持液(98 DMEM/F122 FBS)洗脫3次，培養(yǎng)48 h使細胞趨于靜止。無菌取出蓋玻片，常規(guī)、低氧或不同濃度PDGF條件繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后，用冰PBS快速洗滌3次，10%甲醛固定10 min。計數(shù)5個不同蓋玻片視野細胞數(shù)目（10×）

3、。內(nèi)皮細胞的低氧培養(yǎng)：采用Kuwabara等2介紹的方法并加以改進。主要步驟：常氧培養(yǎng)瓶中灌注99.99% N2，流量68 L/ml，持續(xù)4 min后塞注瓶口培養(yǎng)。3.免疫組織化學檢查：采用SABC法，細胞培養(yǎng)方法大致同上，不同的是培養(yǎng)結(jié)束后無菌取出蓋玻片；免疫組化檢查參照試劑盒說明書。蓋玻片用含1%的Triton的TBS溶液2037處理2 h，3 H2O2室溫下處理510 min，蒸餾水洗2 min×3次，滴加封閉液，室溫10 min，甩去多余液體，滴加適當稀釋兔抗VEGF抗體，2037 12 h，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次。滴加羊抗兔抗體，2037

4、20 min，0.01 mol/L PBS洗2 min×3次，滴加試劑SABC，2037 20 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×4次。DAB顯色，蒸餾水洗滌。封片、照相，IBAS型像處理系統(tǒng)吸光度掃描。4.統(tǒng)計學處理：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩兩樣本均數(shù)比較用t檢驗。二、結(jié)果1.PDGF對于培養(yǎng)內(nèi)皮細胞移行的影響：在培養(yǎng)板中放置蓋玻片，向培養(yǎng)基中給予不同濃度PDGF前取出蓋玻片，顯微鏡下可見HUVEC向蓋玻片區(qū)移行，給予不同濃度PDGF 24 h后計數(shù)蓋玻片上細胞數(shù)目，結(jié)果顯示：低濃度PDGF對培養(yǎng)HUVEC蓋玻片細胞數(shù)目

5、無明顯影響PDGF 5 ng/ml組為（96±13）個/pv，對照組為（87±5）個/pv，P>0.05；高濃度PDGF（10、20 ng/ml）能顯著增加培養(yǎng)HUVEC蓋玻片上細胞數(shù)目分別為（178±22）、（294±16）個/pv ，P<0.001，PDGF濃度為20 ng/ml時引起的蓋玻片上細胞數(shù)目的增加顯著大于PDGF濃度為10 ng/ml時(P<0.01)。由于蓋玻片上細胞數(shù)目可以在一定程度上反映培養(yǎng)HUVEC的移行能力，大劑量PDGF能增加蓋玻片上細胞數(shù)目，說明PDGF能夠刺激培養(yǎng)HUVEC移行。顯微鏡下計數(shù)低氧培養(yǎng)條件下

6、蓋玻片上HUVEC數(shù)目，結(jié)果顯示：低氧培養(yǎng)條件蓋玻片上HUVEC數(shù)目顯著下降低氧組為（52±4）個/ pv，對照組為（87±5）個/pv，P<0.01，HUVEC移行受抑制；不同濃度PDGF均能增加低氧培養(yǎng)條件蓋玻片上細胞數(shù)目低氧加PDGF 5、10、20 ng/ ml組分別為（64±9）、（123±11）、（197±15）個/pv，但僅后兩組與單純低氧培養(yǎng)相比，蓋玻片上細胞數(shù)目顯著增加（P<0.001），而且PDGF劑量越大，增加的細胞數(shù)目越多（P<0.01）；小劑量PDGF與單純低氧培養(yǎng)相比，蓋玻片上細胞數(shù)目增加無顯著性差

7、異（P>0.05）。由此可見，大劑量PDGF能拮抗低氧對HUVEC移行的抑制作用。2.PDGF對于培養(yǎng)內(nèi)皮細胞VEGF表達的影響：用 SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒檢測的HUVEC VEGF陽性胞質(zhì)呈棕黃色。像處理系統(tǒng)測得的平均吸光度結(jié)果顯示：低濃度PDGF對培養(yǎng)HUVEC平均吸光度值無明顯影響（PDGF 5 ng/ml組為0.231±0.012，對照組為0.224±0.021，P>0.05）；高濃度PDGF能顯著增加培養(yǎng)HUVEC平均吸光度值（PDGF 20 ng/ml組為0.291±0.024，P<0.001）。由于吸光度值與培養(yǎng)細胞VEG

8、F表達強弱成正比，表明大劑量PDGF可顯著增加培養(yǎng)HUVEC VEGF的表達。與常規(guī)培養(yǎng)相比，低氧培養(yǎng)時通過免疫組化方法測定的HUVEC平均吸光度值顯著上升（低氧組為0.323±0.025，對照組為0.224±0.021，P<0.001）；缺氧培養(yǎng)基中加入不同濃度的PDGF均可進一步增加HUVEC平均吸光度值（低氧加PDGF 5、20 ng/ml組分別為0.329±0.018、0.379±0.011），但PDGF濃度為5 ng/ml時細胞平均吸光度值與單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)相比差異無顯著性（P<0.05），PDGF濃度為20 ng/ml時HUVEC平均

9、吸光度值與單純?nèi)毖跖囵B(yǎng)相比顯著升高（P<0.001)。研究結(jié)果說明低氧培養(yǎng)條件下HUVEC VEGF表達增強，大劑量PDGF能夠增強低氧條件對于培養(yǎng)HUVEC VEGF表達的影響。三、討論1.PDGF對于培養(yǎng)內(nèi)皮細胞移行的影響：PDGF具有促血管再生作用，在損傷修復、動脈粥樣硬化和腫瘤形成以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用。以往的眾多移行實驗多采用“擦刮法”，本研究改進在培養(yǎng)板中放置蓋玻片，在外源因素干預前無菌取出蓋玻片，最后計數(shù)蓋玻片上細胞數(shù)目，以評價HUVEC移行。結(jié)果表明：低濃度PDGF（5 ng/ml）不影響培養(yǎng)HUVEC移行，高濃度PDGF（10、20 ng/ml）能顯著刺激培養(yǎng)

10、HUVEC移行，蓋玻片上細胞數(shù)目與PDGF濃度正相關(guān)。我們用不同的移行實驗證實低氧可抑制培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的移行，同時證實PDGF可拮抗低氧對HUVEC移行的抑制作用，拮抗強度與PDGF劑量呈正比。5 ng/ml PDGF對低氧培養(yǎng)內(nèi)皮細胞移行無顯著增強作用。2VEGF在血管新生中的作用：VEGF是一種特異性的作用于內(nèi)皮細胞，與血管生長最為直接的生長因子。無論在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復等生理情況下，還是在炎癥、視網(wǎng)膜病變和腫瘤生長等病理情況下，VEGF都與血管的發(fā)生和生長有密切關(guān)系。VEGF主要通過促進內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞增生，刺激內(nèi)皮細胞表達膠原酶，及作為滲透因子增加細胞遷移，從而使新生血管形成。3PD

11、GF對血管組織VEGF水平的影響：大量研究表明在體內(nèi)環(huán)境，多種體液或物理因素均可直接、間接通過增加組織VEGF水平，從而刺激內(nèi)皮細胞的生長，促進新生血管的形成。我們觀察了正常氧、低氧培養(yǎng)條件下，PDGF對于培養(yǎng)HUVEC內(nèi)VEGF表達的影響。結(jié)果表明：無論正常氧或低氧培養(yǎng)條件下，PDGF均能增加HUVEC VEGF表達，且呈劑量依賴性，小劑量作用不顯著；低氧培養(yǎng)條件下HUVEC VEGF表達增強。在增加HUVEC VEGF表達方面，PDGF和低氧有顯著的協(xié)同作用。（本文編輯：常秀青）基金項目：湖北省九五攻關(guān)項目(96291101)作者單位：夏豪（430060 武漢，湖北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)

12、科）黃從新（430060 武漢，湖北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科）李庚山（430060 武漢，湖北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科）李建軍（430060 武漢，湖北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科）尹麗婭（430060 武漢，湖北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科）王晶（430060 武漢，湖北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科）參考文獻1，Gajdusek CM, Luo Z, Mayberg MR. Basic fibroblast growth factor and transforming growth factor beta-1:synergistic mediators of angiogenesis in vitro. J Cell Physiol，1993，157: 133-144. 2，Kuwabara K, Ogawa S, Matsumoto M, et al. Hypoxia-mediated induction of acidic/basic