腫瘤細胞凍存方法的探討

1、腫瘤細胞凍存方法的探討曾艷1,付浩2,韋星呈1,師秀艷2(1.沈陽醫(yī)學院醫(yī)學基礎部免疫學教研室,遼寧沈陽110034; 2.生物化學教研室關鍵詞腫瘤細胞;瘤株;凍存中圖分類號R73-35文獻標識碼B文章編號1008-2344(200602-0156-01腫瘤細胞的培養(yǎng)是開發(fā)新的抗腫瘤新藥的常規(guī)手段。腫瘤研究中移植性腫瘤又稱瘤株傳代也是最基本的常用技術。瘤細胞培養(yǎng)后和瘤株建成后如何將細胞系和瘤株保存好是很值得探討的。現將我們摸索出一套簡便易行、凍存效果好的腫瘤細胞凍存方法報道如下。1冷凍保存時間與腫瘤細胞存活率的關系實驗室得到一個新的腫瘤細胞株后,首先要把該腫瘤細胞株培養(yǎng)擴增后凍存起來。腫瘤細胞

2、凍存可以在由于污染等情況丟失細胞時有備份可用,另外幾乎所有腫瘤細胞在培養(yǎng)傳代的過程中發(fā)生一定程度的變異,為了保持實驗結果的一致性,一般腫瘤細胞在培養(yǎng)幾十代以后就不能使用了,因此需要將凍存的、傳代較少的腫瘤細胞復蘇培養(yǎng)再使用。冷凍保存溫度指能長期保存細胞的超低溫度,在此溫度下,細胞生化反應極其緩慢甚至停止,但經過長期保存,在復蘇后仍能保持正常的結構和功能。不同的細胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果,冷凍保存溫度可以不同1。但從實際和效益的觀點出發(fā),液氮溫度(-196是目前最佳的冷凍保存溫度。在-196時,細胞的生命活動幾乎完全停止,但復蘇后細胞的結構和功能完好。如果冷凍

3、過程得當,一般生物樣品在-196下均可保存十年以上。應用-70 -80保存細胞,短期內對細胞的活性無明顯影響,但隨凍存時間延長,細胞存活率明顯降低。在冰點到-40范圍內保存細胞的效果不佳2。我們采用冷凍保存培養(yǎng)瘤細胞和瘤株已有近10年的經驗,我們觀察了已凍存的1年、2年、5年及8年以上的瘤細胞和瘤株,不同凍存條件對其存活的影響,發(fā)現存放細胞并不是無限期的,在液氮中保存細胞隨著保存年數的增加,細胞存活率下降。5年時細胞存活率僅為40%55%,所以每5年最好重新將種子細胞復蘇后擴增再凍存,以確保種子細胞的存活率。2腫瘤細胞凍存方法的改進冷凍保存瘤細胞和瘤株要比體內、體外傳代保存更為優(yōu)越,瘤細胞凍存

4、后幾乎沒有機械性損傷,可以使培養(yǎng)瘤細胞和瘤株免遭污染和受宿主不同因素影響而改變生物學特性,特別對于那些不常用的但又很重要的細胞系或剛建株后不能立即用于實驗的細胞系及瘤株,低溫保存更為重要。在低于-70的超低溫條件下,有機體細胞內部的生化反應極其緩慢,甚至終止。因此,采取適當的方法將生物材料降低至超低溫,即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當以適當的方法將凍存的生物材料恢復至常溫時,其內部的生化反應可恢復正常。所謂冷凍保存,就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中,以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70的超低溫條件,并在此溫度下對其長期保存的過程。我們凍

5、存細胞時將所需凍存的細胞加入凍存液后直接置于-70冰箱中過夜,第2d放入液氮中。傳統(tǒng)常規(guī)的細胞凍存方法需要將凍存的細胞置于42h,04h,-20過夜,次日取出懸掛液氮罐口30m in后,下降到液氮中保存3。常規(guī)細胞凍存方法有許多弊端:當冷凍速度過慢時,細胞脫水嚴重,細胞體積嚴重收縮,超過一定程度時即失去活性。還會引起細胞外溶液部分結冰,從而使細胞外未結冰的溶液中溶質濃度增高,產生溶質損傷。同時冷凍速度不同也能使細胞內發(fā)生不同的生理變化,可以對細胞產生不同的損傷。因此,超快速玻璃化冷凍對細胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細胞內外呈玻璃化凝固,無冰晶形成或形成很小的冰晶,對細胞膜和細胞器不致造成損

6、傷,細胞也不會在高濃度的溶質中長時間暴露而受損。不同細胞的最適冷凍速率不同。我們的細胞凍存方法與傳統(tǒng)的常規(guī)細胞凍存方法比較而言,省時、省力、簡便易行,更為重要的是細胞凍存效果好。對短期(數周或數月不用的細胞可保存于-70低溫冰箱中。但暫時存放時間不宜過長,因1年存活率僅為34%,若要長期保存還應放入液氮罐中。由此可見,要想獲得凍存細胞的最大活性,影響因素很多,它們相互影響,相互作用,無論那一方面均不可忽視。如何更好的長時間凍存細胞又能保存其活性還有待進一步探討。參考文獻:1王麗英,于鴻.不同種類細胞培養(yǎng)和凍存方法的改進J .實用腫瘤學雜志,1998,12(1:12.2薛慶善.體外培養(yǎng)的原理和技

7、術M .北京:北京科學出版社,2001.128-136.3龔守良.實用基礎醫(yī)學實驗技術M .吉林:吉林科學技術出版社,1990.233-245.收稿日期2005-10-09阿霉素微乳的制備方法孟俐麗1,王俊平2 (沈陽醫(yī)學院科研處,遼寧沈陽110034;21醫(yī)學基礎部藥理教研室關鍵詞長循環(huán)阿霉素微乳;急性毒性;抗癌作用中圖分類號R965文獻標識碼B 文章編號1008-2344(200602-0157-02阿霉素(doxorubicin,DR 是一種蒽醌類抗生素,用于治療腫瘤,但不良反應多且嚴重1。乳劑中分散微粒大小介于50100nm ,透明或半透明液體的乳劑稱為微乳(m icr oe muls

8、i on ,可作為一種抗癌藥物新劑型。微乳可用于運載抗癌藥物,能夠顯著提高藥物的抗癌作用,同時減輕或減少其不良反應2,3。為減輕DR 的不良反應,同時提高其療效,我們采用油酸為相,聚乙二醇2二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG 2DSPE 為乳化劑,研制阿霉素微乳(doxo 2rubicin m icr oe mulsi on,DR 2M ,初步評價其急性毒性和抗癌效果。1材料與方法1.1材料阿霉素:由海門制藥廠生產;鴉膽子油,由沈陽藥科大學制藥廠提供;PEG -DSPE,購自美國Avanti Polar L i p ids 公司;昆明種小白鼠,雌雄各半,體重(20±2g,艾氏腹水癌(E

9、AC ,Hep s 腹水型,由課題組所在單位提供;日本島津高效液相色譜系統(tǒng),S LC 26A,附SP D 2G AV 型全波長紫外檢測器;國產RE52298型旋轉蒸發(fā)器;國產FSH 22A 可調高速勻漿機;國產S LJ 21型離心機。1.2阿霉素微乳的制備制備阿霉素(DR 和油酸(OA 的復合物(DR 2OA ,與PEG 2DSPE (PEG 分子量:2000一起溶于氯仿,然后采用旋轉蒸發(fā)器制備脂質薄膜。在50的水浴中,將上述脂質薄膜用10%葡萄糖水合20m in,轉入冰浴中,用高速勻漿機分散5m in,100n m 微孔濾膜過濾,即得阿霉素微乳。1.3阿霉素的分析方法采用HP LC 測定DR

10、 含量,色譜條件是在文獻報道的基礎上,結合我們的儀器條件而建立的3漿中DR 的提取”項下程序處理樣品,提取上述標準樣品中的DR 。在上述色譜條件下,測定所提取的DR 的峰面積。以峰面積為縱坐標,血漿中DR 濃度為橫坐標X,進行線性回歸,得HP LC 測定血漿中DXR 的標準曲線方程:Y =169.96+6508.21X ,r =0.9992。血漿中DR 的平均回收率為87.97%,精密度不超過4%。1.4血漿中DR 的提取采用提取后測定法測定DR 的血漿藥物濃度。提取方法參考文獻方法1。取樣條件:6mg DR /kg 動物,靜脈注射單劑量給藥,于不同時刻取3只動物斷頭采血,置肝素抗凝的干燥試管中,按如下程序提取DR:取血漿0.6m l 與0.6m l P BS (pH =9.1