膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告模板二

1、膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè) 年級(jí)專業(yè)：14臨床輸血 學(xué)號(hào)： 3140704004 姓名：寧立軍 組別： 第七組 合作者：牛愷文 黃可秀 朱晉輝 實(shí)驗(yàn)室：第六實(shí)驗(yàn)室 指導(dǎo)老師：羅軍 實(shí)驗(yàn)的得分：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)革蘭氏染色并在油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)菌的生化反應(yīng)和細(xì)菌的血清學(xué)反應(yīng)等手段區(qū)別和鑒定膿汁標(biāo)本中和糞便標(biāo)本中細(xì)菌，檢測(cè)病原微生物，并進(jìn)行細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)。二、實(shí)驗(yàn)器材1器材 接種環(huán) 接種針 打火機(jī) 馬克筆 酒精燈 電熱恒溫培養(yǎng)箱 物顯微鏡 電爐 試管（帶棉塞） 稱量紙 藥勺 牛皮紙 橡皮筋 尺子 錐形瓶 高壓蒸汽滅菌器 鑷子 玻片 吸水紙 2 試劑藥品 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 蒸餾水 膿

2、汁標(biāo)本 糞便標(biāo)本 石蠟油 生理鹽水 結(jié)晶紫 盧戈碘液 95%乙醇 稀釋復(fù)紅 葡萄糖微量發(fā)酵管（2支） 乳糖微量發(fā)酵管（2支） 青霉素抗菌素紙片 鏈霉素抗菌素紙片 慶大霉素抗菌素紙片 兔血漿 福氏志賀菌診斷血清三、方法與步驟1培養(yǎng)基制備 稱取一定量的肉湯培養(yǎng)基，至于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水，煮沸一次，趁熱分裝；稱取一定量的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，至于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水，煮沸三次（煮至剛剛冒泡，立刻置于臺(tái)面，半分鐘后再煮），使完全溶解，趁熱分裝。（平板培養(yǎng)基：以無(wú)菌操作，傾注平皿10ml，瓊脂完全凝固后，平板倒放，4冰箱保存?zhèn)溆?。斜面培養(yǎng)基：培養(yǎng)基趁熱斜放，培基不超過(guò)試管長(zhǎng)度的2/3，瓊脂凝

3、固以后，4冰箱保存?zhèn)溆?。）貼上標(biāo)簽后滅菌使用。2空氣與人體體表細(xì)菌學(xué)檢查根據(jù)空氣中細(xì)菌氣溶膠粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)以后，計(jì)數(shù)菌落形成單位（CFU），了解空氣的污染情況。平板蓋打開(kāi)，蓋朝下放在平板旁，瓊脂平板暴露15分鐘即可。 在普通平板上接種手指上的細(xì)菌。第1格為洗手前，第2格為洗手后，第3格為消毒后，第4格空白對(duì)照。 3細(xì)菌分離培養(yǎng) 接種前，接種環(huán)燒灼滅菌。取標(biāo)本在平板表面上方密集涂布510 mm。燒掉接種環(huán)上多余的標(biāo)本。冷卻后，應(yīng)用分區(qū)劃線分離法，將膿汁標(biāo)本接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（2份），糞便標(biāo)本接種于伊紅美藍(lán)平板（2份）。接種完畢后，接種環(huán)燒灼滅菌。

4、將平板倒置37培養(yǎng)1824h,觀察結(jié)果 。4細(xì)菌的群體生長(zhǎng)特性觀察和純化培養(yǎng) 觀察細(xì)菌分離培養(yǎng)物中菌落特征，并記錄。選取平板上相同的菌落數(shù)多的，典型的，容易挑取的單菌落。通過(guò)無(wú)菌操作輕刮取菌，接種于斜面培養(yǎng)基中。接種完畢，灼燒接種環(huán)，斜面培養(yǎng)基置于37培養(yǎng)過(guò)夜。5細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)特征的觀察 斜面培養(yǎng)物的觀察革蘭氏染色：取潔凈載玻片，用滅菌操作后的接種環(huán)取生理鹽水1-2環(huán)于玻片上，挑取細(xì)菌培養(yǎng)物少許與鹽水輕輕抹勻。待涂片干燥后在酒精燈火焰外側(cè)快速來(lái)回2-3回合，使標(biāo)本固定，進(jìn)行染色。結(jié)晶紫染液初染1分鐘后水洗，蘆戈氏碘液媒染一分鐘后水洗，95%酒精脫色20-30s，水洗，稀釋復(fù)紅復(fù)染一分鐘后水洗。

5、待標(biāo)本晾干后滴加香柏油，油鏡下觀察。通過(guò)無(wú)菌操作，分別在斜面培養(yǎng)物中挑取菌苔少許，立即移入肉湯培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調(diào)和，使菌液混合語(yǔ)培養(yǎng)基中，混勻。接種完畢，試管口通過(guò)火焰2-3次滅菌，塞好棉塞。接種環(huán)灼燒后放下。6細(xì)菌的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 通過(guò)無(wú)菌操作，用滅菌接種針刮取新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物少許，分別接種在葡萄糖發(fā)酵微量管中和乳糖發(fā)酵微量管內(nèi)。將微量管平放在平皿內(nèi)，37培養(yǎng)過(guò)夜后觀察結(jié)果。7血漿凝固酶實(shí)驗(yàn) 取干凈玻片一張，在左右兩邊分別滴加兔血漿1-2滴，生理鹽水1滴。將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒滅菌冷卻后，取細(xì)菌新鮮培養(yǎng)物少許，在生理鹽水中研磨混勻成細(xì)菌懸液。用滅菌接種環(huán)取

6、細(xì)菌懸液1環(huán)，或挑取細(xì)菌培養(yǎng)物少許，在兔血漿中輕輕抹勻。稍等片刻，觀察結(jié)果。8血清學(xué)實(shí)驗(yàn) 取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設(shè)為對(duì)照區(qū)，滴加生理鹽水15ul。遠(yuǎn)端設(shè)為試驗(yàn)區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清15ul，用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻。載玻片來(lái)回傾側(cè)，讓菌液充分混勻，凝集速度更快、結(jié)果更清楚。9半固體穿刺培養(yǎng) 接種針滅菌處理后挑取菌苔少許，垂直刺入半固體培養(yǎng)基中心，可刺達(dá)近底管處，但不要到達(dá)管底，然后沿原路退出。接種完畢，試管口迅速通過(guò)火焰2-3次滅菌，塞好棉塞。接種針灼燒后放下。37培養(yǎng)過(guò)夜。10細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn) 接種環(huán)取菌液在平板培養(yǎng)基表面，拉出2條細(xì)菌接種線，使呈

7、“十字形”。平板密集劃線接種細(xì)菌。設(shè)計(jì)三點(diǎn)，呈等邊三角距離，點(diǎn)距離平皿邊緣約15mm。作標(biāo)記：青、鏈、慶。鑷子火焰消毒，夾取相應(yīng)的藥物紙片，平貼在已設(shè)定的位置上，按壓，鑷子火焰滅菌。371824小時(shí)培養(yǎng)，觀察結(jié)果。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1、空氣與人體體表細(xì)菌學(xué)檢查（1）空氣：菌落數(shù)：16個(gè)，采集地點(diǎn)：廁所。由CFU /m3 50,000NAT 86N(直徑7cm平板）實(shí)驗(yàn)室空氣細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)。N：平板上的菌落數(shù)，A：平板面積(38.5cm2)，T：采樣時(shí)間(15分鐘)分析討論：在課堂上，和其他組比較發(fā)現(xiàn)，微生物實(shí)驗(yàn)室中空氣細(xì)菌是比較多的，而廁所反而菌落少，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室是封閉的，而且人流量大，故而空氣

8、中的細(xì)菌也就多了，廁所人流量少，反而干凈。（2）人體體表：手指皮膚的細(xì)菌學(xué)檢查我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)還是普通洗手后，平板上菌落的數(shù)量與洗手前的是差不多的，甚至還多些，而消毒后的我們組兩個(gè)同學(xué)的沒(méi)發(fā)現(xiàn)菌落，空白對(duì)照出有兩個(gè)同學(xué)的都有一個(gè)菌苔洗前細(xì)菌種類多，洗后細(xì)菌種類少。分析討論：對(duì)于普通洗手的同學(xué)來(lái)說(shuō)，由于暫駐細(xì)菌未能完全清洗干凈，而常駐細(xì)菌又暴露了，故洗手后測(cè)到的細(xì)菌反而多了，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)洗手的同學(xué)來(lái)說(shuō)，暫駐細(xì)菌可能是完全洗凈，但暴露的常駐細(xì)菌可能與暫駐細(xì)菌相當(dāng)或比之還多，因此出現(xiàn)該結(jié)果。而用碘酒消毒后未發(fā)現(xiàn)菌落，說(shuō)明碘酒消毒可以消毒徹底。而空白對(duì)照說(shuō)明我們手指皮膚上的細(xì)菌比空氣中的多。2細(xì)菌分離培

9、養(yǎng) 濃汁標(biāo)本平板 糞便標(biāo)本平板膿汁標(biāo)本在普通平板上有黃色、白色兩種菌落，圓形、隆起、表面光滑、邊緣整齊、不透明。糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、淡粉紅色兩種菌落。紫黑色菌落具有金屬光澤、大而隆起、不透明。淡粉紅色菌落半透明。分析討論：用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本中分離出紫黑色具有金屬光澤和粉紅色半透明菌落，顯微鏡下均為G-桿菌，散在排列。紫黑色金屬光澤的產(chǎn)生是因?yàn)槿樘潜环纸猱a(chǎn)酸，酸使伊紅美和藍(lán)紫結(jié)合，產(chǎn)生紫黑金屬光澤菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大腸埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈現(xiàn)伊紅的顏色。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。3細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)特征的觀察 G-桿菌 G+球菌 分析討論：用伊

10、紅美藍(lán)平板,從糞便標(biāo)本分離，獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。顯微鏡下，均為G-桿菌，散在排列。用普通平板，從膿汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細(xì)菌，顯微鏡油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀。4細(xì)菌的糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分析討論：糞便標(biāo)本分離菌糖發(fā)酵試驗(yàn)中，紫黑色菌落菌種的葡萄糖和乳糖微量發(fā)酵管都為黃色，有氣體產(chǎn)生；粉紅色菌落菌種的葡萄糖微量發(fā)酵管為黃色，不產(chǎn)氣，乳糖微量發(fā)酵管無(wú)明顯變化。5血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)?zāi)撝瓨?biāo)本分離菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)中，黃色菌種菌液出現(xiàn)明顯凝塊，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性；白色菌種未出現(xiàn)凝集反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。分析討論：通過(guò)血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，黃色菌種實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，為致病菌。6血清

11、學(xué)實(shí)驗(yàn)玻片凝集試驗(yàn)中，粉紅色菌落菌種在福氏志賀菌診斷血清中出現(xiàn)片狀凝集現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性；而在生理鹽水中未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。分析討論：通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，粉紅色菌落菌種與福氏志賀菌診斷血清發(fā)生凝集反應(yīng)，確定其為福氏志賀菌。7半固體穿刺培養(yǎng) 半固體培養(yǎng)基中，紫黑色菌落菌種擴(kuò)散生長(zhǎng)，培養(yǎng)基呈擴(kuò)散云霧混沌狀態(tài)；粉紅色菌落菌種沿穿刺線生長(zhǎng)，穿刺線邊緣整齊，周圍培養(yǎng)基清澈透明。分析討論：半固體動(dòng)力試驗(yàn)表明紫黑色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，有鞭毛；粉紅色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陰性，無(wú)鞭毛。8細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn) 白色細(xì)菌平板 黃色細(xì)菌平板 粉紅色菌種平板 紫黑色菌種平板各菌落抑菌圈直徑青霉素頭孢曲松慶大霉

12、素黃色菌種42mm25mm30mm白色菌種30mm22mm40mm紫黑色菌種無(wú)作用37mm26mm粉紅色菌種無(wú)作用36mm38mm分析討論：由于青霉素針對(duì)的是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，因此對(duì)白色菌落和黃色菌落是高度敏感的，而頭孢曲松和慶大霉素都是廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌都較為敏感，因此對(duì)四種菌落都有較好的抑菌作用，這也說(shuō)明我們不能單從這些細(xì)菌的抗藥敏性實(shí)驗(yàn)中得出細(xì)菌的種屬，應(yīng)結(jié)合多個(gè)生化反應(yīng)進(jìn)行判斷。五、實(shí)驗(yàn)綜合討論1、用普通平板，從膿汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，油鏡下均為G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌分別是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌

13、。致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白,附著于菌體表面,形成凝塊。通過(guò)血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，為致病菌。用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本中分離出紫黑色具有金屬光澤和粉紅色半透明菌落，顯微鏡下均為G-桿菌，散在排列。紫黑色金屬光澤的產(chǎn)生是因?yàn)槿樘潜环纸猱a(chǎn)酸，酸使伊紅美和藍(lán)紫結(jié)合，產(chǎn)生紫黑金屬光澤菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大腸埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈現(xiàn)伊紅的顏色。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)（紫黑色菌落菌種分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅色菌落菌種只能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）半固體動(dòng)力試

14、驗(yàn)（紫黑色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，有鞭毛；粉紅色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陰性，無(wú)鞭毛）。對(duì)照常見(jiàn)腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征，判定它們分別是大腸埃希菌和福氏志賀菌。通過(guò)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，粉紅色菌落菌種與福氏志賀菌診斷血清發(fā)生凝集反應(yīng)，進(jìn)一步確定其為福氏志賀菌。腸道桿菌科各菌屬生化反應(yīng)鑒別表葡萄糖乳糖麥芽糖甘露醇蔗糖半固體埃希菌屬+志賀菌屬+/-/+-沙門菌屬/+-+霍亂弧菌+-+變形桿菌屬-+注： + 產(chǎn)酸或陽(yáng)性， 產(chǎn)酸產(chǎn)氣，- 陰性，+/- 多數(shù)陽(yáng)性， -/+ 多數(shù)陰性 不確定。常見(jiàn)腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征葡萄糖乳糖半固體大腸埃希菌+福氏志賀菌+傷寒沙門菌+霍亂弧菌+幽門螺桿菌不分解糖類+變形桿菌+2、對(duì)照常用藥敏試驗(yàn)紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)，金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌對(duì)青霉素、慶大霉素、鏈霉素均敏感。大腸埃希菌對(duì)青霉素耐藥，慶大霉素、鏈霉素敏感，福氏志賀菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)慶大霉素、鏈霉素敏感?？傻媒Y(jié)論G+球菌對(duì)青霉素和鏈霉素敏感。 G-桿菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)鏈霉素敏感。G+球菌和G-桿菌對(duì)廣譜抗菌素慶大霉素都