熒光定量PCR技術(shù)臨床應(yīng)用ppt課件

1、.熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)在臨床技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用及注意事項(xiàng)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用及注意事項(xiàng).內(nèi)內(nèi) 容容 提提 要要一、基因診斷技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的地位二、熒光探針定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用三、熒光探針定量PCR在臨床醫(yī)學(xué)中的主要問(wèn)題.基因診斷的基因診斷的物質(zhì)基礎(chǔ)及物質(zhì)基礎(chǔ)及與其它與其它診斷方法的診斷方法的區(qū)別區(qū)別基因診斷免疫學(xué)診斷臨床診斷細(xì)胞膜細(xì)胞核DNA轉(zhuǎn)錄 mRNA翻譯蛋白質(zhì)臨床表現(xiàn)生化診斷.臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)發(fā)展 三個(gè)時(shí)代三個(gè)時(shí)代 標(biāo)志技術(shù)標(biāo)志技術(shù) 性質(zhì)性質(zhì)生化診斷時(shí)代 生化分析 表象免疫學(xué)診斷時(shí)代 酶免、放免 表象分子(基因)診斷時(shí)代 基因體外擴(kuò)增(PCR) 本質(zhì)

2、.1、病原體的定量檢測(cè)及藥物療效考評(píng)（HBV）2、腫瘤基因和腫瘤標(biāo)志物表達(dá)(mRNA)的檢測(cè)（P53 ）3、遺傳病基因的檢測(cè)（地中海貧血 ）4、與疾病相關(guān)的各種蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的定量檢測(cè)6、建立病原體的分子診斷標(biāo)準(zhǔn)熒光定量熒光定量PCRPCR在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用.熒光定量熒光定量PCRPCR在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用一、肝炎病毒定量檢測(cè)二、性病病原體檢測(cè)三、優(yōu)生優(yōu)育相關(guān)項(xiàng)目檢測(cè)四、結(jié)核桿菌及呼吸道病原體檢測(cè)五、其他病原體檢測(cè).病毒性肝炎概況 病毒性肝炎是由多種肝炎病毒引起，以肝臟炎癥和壞死病變?yōu)椴《拘愿窝资怯啥喾N肝炎病毒引起，以肝臟炎癥和壞死病變?yōu)橹鞯囊唤M傳染病。

3、按病毒的生物學(xué)特征、臨床和流行病學(xué)特征，主的一組傳染病。按病毒的生物學(xué)特征、臨床和流行病學(xué)特征，1989年在日本東京的國(guó)際肝炎學(xué)術(shù)討論會(huì)上，將其分為甲（年在日本東京的國(guó)際肝炎學(xué)術(shù)討論會(huì)上，將其分為甲（A）型、乙（型、乙（B）型、（）型、（C）型、丁（）型、丁（D）型、戊（）型、戊（E）型肝炎，以后）型肝炎，以后還報(bào)道了己（還報(bào)道了己（F）型和庚（）型和庚（G）型。）型。 我國(guó)是個(gè)肝炎大國(guó)，病毒性肝炎發(fā)病數(shù)位居法定管理傳染病的我國(guó)是個(gè)肝炎大國(guó)，病毒性肝炎發(fā)病數(shù)位居法定管理傳染病的第一位，僅乙型肝炎病毒感染者就達(dá)第一位，僅乙型肝炎病毒感染者就達(dá)1.2億，每年新增加的感染億，每年新增加的感染者也在百

4、萬(wàn)以上，丙肝發(fā)病率亦趨上升。慢性乙型肝炎病程遷者也在百萬(wàn)以上，丙肝發(fā)病率亦趨上升。慢性乙型肝炎病程遷延，如得不到及時(shí)的治療，部分將會(huì)發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，延，如得不到及時(shí)的治療，部分將會(huì)發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。.HBV基因型與血清型關(guān)系及流行病基因型與血清型關(guān)系及流行病學(xué)分布學(xué)分布基基因因型型血清學(xué)亞型血清學(xué)亞型基因長(zhǎng)基因長(zhǎng)度度(nt)臨床突變率臨床突變率主要主要流行地域流行地域PC*(G1896A)BCP*(1762/1764)Badw2ayw1321550（常）（常）T185816東南亞、中國(guó)、東南亞、中國(guó)、日本日本Cayr;adrq+;Adrq-;adr

5、;adw2321550（常）（常）T1858或或C185858（常）（常）東南亞、中國(guó)、東南亞、中國(guó)、日本、澳洲、日本、澳洲、美國(guó)美國(guó).病原學(xué)病原學(xué)乙型肝炎檢測(cè)標(biāo)志物lHBsAg，抗-HBslHBeAg，抗-Hbel抗HBclHBV-DNA.乙型肝炎免疫檢測(cè)和PCR結(jié)果異同 “大三陽(yáng)” PCR結(jié)果陰性 抗-HBs陽(yáng)性，PCR結(jié)果陽(yáng)性.熒光定量PCR技術(shù)對(duì)性傳播疾病的檢測(cè)一、淋球菌（NGH）二、沙眼衣原體、解脲脲原體（CT、UU）(有證）三、梅毒螺旋體（TP）四、單純庖疹病毒（HSV）五、乳頭瘤病毒（HPV）（有證）六、人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）.PCR技術(shù)對(duì)性傳播疾病檢測(cè)的注意事項(xiàng)1標(biāo)本的選取

6、 TP HSV 2臨床療效考評(píng) .超高倍.熒光定量熒光定量PCRPCR診斷TORCH綜合征傳統(tǒng)的TORCH病原體：TOX, other, RV, CMV, HSV新近發(fā)現(xiàn)的TORCH：麻疹V、腮腺炎V、水痘帶狀 庖疹V、腸道V、乙肝V、丙肝V、 HPV、EBV、HIV、人庖疹V6、 人微小病毒B19等.TORCHTORCH感染的實(shí)驗(yàn)室診斷感染的實(shí)驗(yàn)室診斷一、組織培養(yǎng)：慢，費(fèi)力，陽(yáng)性率低二、血清學(xué)診斷： IgG： IgM： 1、不能定量分析 2、抗體的產(chǎn)生受多種因素的影響 3、產(chǎn)生假陽(yáng)性三、基因診斷方法 原理：檢測(cè)TORCH病原體的核酸 優(yōu)點(diǎn)：1、客觀指標(biāo) 2、敏感性、特異性高 3、定量指標(biāo) 熒

7、光定量PCR在TORCH診斷中的應(yīng)用： 1、篩選TORCH的患者 2、建立TORCH的分子診斷標(biāo)準(zhǔn).熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)TOX孕婦TOX感染的危害 孕早期（多少，也可對(duì)樣本稀釋后再檢測(cè)；如低于此范圍，則報(bào)告多少，如103拷貝數(shù)/ml，而不能報(bào)告為0拷貝數(shù)/ml或陰性。 拷貝數(shù)與病原體的關(guān)系：拷貝數(shù)與病原體的數(shù)量成正相關(guān) 。一般來(lái)說(shuō)細(xì)菌是多拷貝的，病毒是單拷貝的。 DNA拷貝數(shù)單位和質(zhì)量單位：100拷貝HBV0.04fg 國(guó)際單位IU.拷貝數(shù)拷貝數(shù)/ml/ml的確定：的確定：DNA/RNA 參考品（質(zhì)粒等）參考品（質(zhì)粒等）測(cè)量OD260的值得到mg/ml通過(guò)與分子量的計(jì)算

8、，得到拷貝數(shù)/ml 不同實(shí)驗(yàn)室得到的結(jié)果差別很大。.HCVHCV國(guó)際單位與拷貝數(shù)換算國(guó)際單位與拷貝數(shù)換算NGI NGI SuperQuant:SuperQuant: 1 IU/mL = 3.4 copies/ml1 IU/mL = 3.4 copies/ml (NGI Product License Application to FDA ) (NGI Product License Application to FDA )Roche Roche Amplicor Monitor v2.0Amplicor Monitor v2.0 1 1 IU/mL = IU/mL = 0.9 copies/m

9、l0.9 copies/ml (Roche Molecular Systems) (Roche Molecular Systems)Cobas Amplicor Monitor HCV v2.0Cobas Amplicor Monitor HCV v2.0 1 IU/mL = 2.7 copies/ml1 IU/mL = 2.7 copies/ml (Roche Molecular Systems) (Roche Molecular Systems)LCx HCV RNA Quantitative AssayLCx HCV RNA Quantitative Assay 1 IU/mL = 3.

10、8 copies/ml1 IU/mL = 3.8 copies/ml (Abbott Diagnostics)(Abbott Diagnostics)Bayer bDNA 3.0:Bayer bDNA 3.0: 1 IU/mL = 5.2 copies/ml1 IU/mL = 5.2 copies/ml (Bayer Development Group)(Bayer Development Group) .未知未知HCV RNA 樣本樣本甲實(shí)驗(yàn)室 5000拷貝/ml 乙實(shí)驗(yàn)室 10000拷貝/ml 丙實(shí)驗(yàn)室 50000拷貝/ml 丁實(shí)驗(yàn)室 20000拷貝/ml 實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的互通性實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的互通性.20000IU/mlHCV RNA 樣本樣本甲實(shí)驗(yàn)室 40000拷貝/