RNA提取標(biāo)準(zhǔn)流程參考模板

1、RNA提取標(biāo)準(zhǔn)流程原理：TRIzol試劑適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNA。TRIzol使樣品細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中，取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA。預(yù)防RNase污染注意事項(xiàng)：1 經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細(xì)菌，霉菌可能成為RNase的來源。2 使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。3 RNA提取過程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高壓滅菌，然后烘干即可。4 配制溶液應(yīng)使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度

2、0.05% v/v，充分混勻后37ºC放置過夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇（可保存在-20ºC，用時(shí)取出置于冰上），75%乙醇，無RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC處理過的水配制。10×Loading buffer（寶生物工程（大連）有限公司，貨號：D603，35元，1mL×5支）準(zhǔn)備器材：1 mL、200 L槍頭、小燒杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Eppendorf管若干、報(bào)紙、卷紙、研缽，以上物品全部需要高壓。操作步驟:1. 研磨+勻漿：將組織在液氮中磨

3、碎（大體積不均一的樣品，如下丘腦、海馬等神經(jīng)組織、成年動物腎上腺等腺體，必須對整個(gè)組織研磨），取50100 mg1 / 10組織樣品（肝臟可減少樣品量到30 mg）放入2 mL離心管中，稱重記錄；均一組織或者小體積的不均一組織可直接稱重后勻漿。每50100 mg組織加入1 mL TRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10%。2將勻漿樣品在室溫（1530ºC）放置5 min（可延長到15 min），使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖（如肝臟和肌肉中的糖原）或胞外物質(zhì)（肌肉）可于28 10000 × g離心10

4、 min，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量基因組DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液轉(zhuǎn)入2 mL管中進(jìn)行下一步操作。3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩60 s（可使用混勻器，也可手動劇烈顛倒混勻），室溫放置3 min。（可延長震蕩時(shí)間和放置時(shí)間到15 min，同GTC法）4. 4ºC 10000 × g離心15 min。樣品分為三層：底層為紅色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。（即1mL最多600µl，為保證RNA

5、質(zhì)量，可適量減少抽取量，防止抽到下層）5. 記錄抽取水相的量，把水相轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL Eppendorf管中，用等體積的預(yù)冷的異丙醇沉淀水相中的RNA。 a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL異丙醇，室溫放置10 min。 b. 可選：應(yīng)對糖原含量較高的組織（如肌肉和肝臟）：每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL異丙醇和0.25 mL高鹽溶液（0.8 M檸檬酸鈉和1.2 M NaCl）混合離心，這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。6. 4ºC 10000 × g離心10 min，離心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝臟等富含糖原的組

6、織可能出現(xiàn)大量糖原沉淀），離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)白色半透明狀沉淀。棄上清。8. 向1.5 mL Eppendorf管中加入75%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol至少加1 mL 75%乙醇。4不超過7500×g離心5 min，棄上清。9. 室溫放置于超凈臺通風(fēng)口（墊上已滅菌的吸水紙）干燥RNA沉淀，大約晾510 min即可，過于干燥會導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入適量DEPC水，記錄使用的DEPC水體積（適量是指加入水后仍能保證RNA濃度至少 0.5 g/L，但不影響溶解，濃度在4 g/L以上的RNA較容易出現(xiàn)溶解不完全的情況），使之充分溶解（可選擇4放置1 h以上或

7、5565ºC水浴10 min），之后才可以進(jìn)行測濃度、DNA污染的PCR驗(yàn)證、RNA變性電泳等后續(xù)操作。RNA應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移至-70ºC保存。 也可用100%的去離子甲酰胺溶解（用于northern的RNA可這樣保存于-20ºC）。補(bǔ)充說明：1. 從少量樣品（110 mg組織或102104細(xì)胞）中提取RNA時(shí)可加入少許線性丙烯酰胺等助沉劑以促進(jìn)RNA沉淀。操作示例：加800 µL TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加濃度為5 mg/mL的線性丙烯酰胺23L RNase-free線性丙烯酰胺溶液。它在使用時(shí)最終工作濃度應(yīng)該為1020 g/mL。線性丙烯酰胺會與

8、RNA一同沉淀出來，線性丙烯酰胺濃度不高于5 µg/µL不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。線性丙烯酰胺制備方法見附錄1。2. 勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70ºC保存至少一個(gè)月。3. 若提取的組織內(nèi)源性RNAase含量較高（如胰腺），可將全部過程置于冰上操作，同時(shí)適當(dāng)延長放置時(shí)間。預(yù)期產(chǎn)量：1 mg組織或1×106細(xì)胞提取RNA分別為：肝和脾610 g，腎34 g，骨骼肌和腦組織11.5 g，胎盤14 g，上皮細(xì)胞 815 g，成纖維細(xì)胞 57 g。RNA的質(zhì)量控制：1. RNA的吸收峰應(yīng)在260nm，左偏峰少見，右偏峰提示可能有酚污染。2

9、. 對于RNA純品：A260/A280=1.81 (溶于水)；A260/A280=2.04 (溶于TE：10mM Tris-HCl 1mM EDTA pH=8.0)；A260/A230>2。3. nanodrop使用0.2mm光徑，但默認(rèn)顯示的是換算后的1cm光徑吸光值，并非其精度能夠檢測3以上的吸光值（2%以下的透光率）。4. 對于ND-1000（本實(shí)驗(yàn)室機(jī)器型號），其RNA檢出限為2-3000ng/L，大于3000ng/L需要稀釋后再測。 1. 使用nanodrop測量RNA吸光值時(shí)的幾點(diǎn)說明：圖一、RNA紫外吸收光譜圖三、A260/A280<1.8，提示可能存在蛋白、酚污染圖

10、二、A230過高圖像，提示可能存在多糖、異丙醇、高濃度無機(jī)鹽殘余2. PCR驗(yàn)證基因組DNA污染：使用RNA作為模板，使用不跨內(nèi)含子的引物采用進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，若可以擴(kuò)增出條帶，則說明存在DNA污染。 注：驗(yàn)證時(shí)，必須有陰性和陽性對照，陰性對照的模板為DEPC水，陽性對照的模板為cDNA。3. RNA甲醛變性膠驗(yàn)證質(zhì)量：變性膠做法（每100 mL）：72 mL水，1.4 g Agarose (1.4%，膠濃度可調(diào))，加熱煮沸，待冷卻到約60ºC時(shí)， 加入 10 mL 10×MOPS （配制方法見附錄1），18 mL 甲醛溶液（37%， pH > 4.0），混勻（避免

11、產(chǎn)生氣泡）倒入膠槽內(nèi)，冷卻2 h后使用。（放置過長時(shí)間會導(dǎo)致甲醛揮發(fā)，影響電泳結(jié)果）樣品處理方法：將RNA稀釋到1 g/L，取4.4 L（可減少點(diǎn)樣RNA量，但需要保證體積），加2 L的10×MOPS，3.6 L的甲醛，10 L的去離子甲酰胺，共20 L，混勻之后將樣品置于65ºC水浴變性15 min，迅速置于冰上冷卻。之后加入2 L 10×loading buffer，0.1 L EB（10 mg/mL），混勻后即可點(diǎn)樣。電泳：5 V/cm電壓，電泳約40 min后（或指示劑到膠的2/3處）照相。注: 若成像結(jié)果不佳，可選擇EB后染，即不將EB混入樣品中，在電泳

12、完成后，使用1 g/mL（儲存液稀釋10000倍即可）的EB染膠15 min，清水脫色15 min或更長時(shí)間，圖像對比度會更高，且不會出現(xiàn)反向的EB亮斑。電泳結(jié)果分析：好的RNA電泳圖可見28S和18S的清晰圖像，且亮度呈2倍的關(guān)系。圖四、RNA電泳示例圖，2%的變性膠，對比度經(jīng)過調(diào)整美化常見問題分析：得率低：A樣品裂解或勻漿處理不徹底BRNA沉淀未完全溶解A260/A280<1.65 ：A檢測吸光度時(shí)，RNA樣品沒有溶于TE，而溶于了水中，低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高，水中1.51.8的比值都可能是質(zhì)量較好的RNAB樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少（造成蛋白未分離完全）C勻漿樣品時(shí)

13、未在室溫放置5 minD吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相ERNA沉淀未完全溶解RNA降解：A組織取出后沒有馬上處理或冷凍B待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70ºC，而保存在了-5至-20C細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過度D溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理E電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5DNA污染: A 樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少B 樣品中含有有機(jī)溶劑（如乙醇，DMSO等），強(qiáng)緩沖體系或堿性溶液附錄一、線性丙烯酰胺制備方法1. 配5%的丙烯酰胺（acrylamide）溶液：A配制buffer 100 mL（40 mM Tris-HCl （pH= 8），20 mM 醋酸鈉, 1 mM EDTA）：

14、稱取2.72 g無水醋酸鈉，溶于50 mL DEPC水中，向其中加入1 M Tris-Cl （pH=8.0）4 mL，0.5 M EDTA （pH=8.0）0.2 mL，加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，再加DEPC水至100 mL。B稱取5 g 丙烯酰胺，加入 100 mL buffer中，高壓滅菌后分裝至高壓過的1.5 mL管中，每管0.2 mL。2. 加過硫酸銨（AP）到終濃度為0.1 %（w/v）：A配制10 % AP儲存液（w/v）：稱取0.1 g AP，溶解于1 mL DEPC水中。B向每管5%的丙烯酰胺溶液中加入2 L 10 % AP。3. 加TEMED到終濃度為1/1000（v/v），

15、即向每管中加入0.2 µL TEMED，室溫聚合30min。4. 待溶液變粘稠，向管中加入2.5倍體積（500 µL）的乙醇沉淀聚合物，-20 沉淀30 min以上。5. 12000×g離心5 min，沉淀即為線性的丙烯酰胺，每管加入1mL 1×TE buffer 溶解（溶解時(shí)間較長，可4 過夜）， 即得到終濃度為10 mg/mL的線性的丙烯酰胺1 mL。封口膜密封保存于-20 ，可保存2年。 1×TE buffer（ 10 mM Tris-Cl，pH=8.0；1 mM EDTA）配制方法：加入1 M Tris-Cl （pH=8.0）1 mL，0.5 M EDTA （pH=8.0）0.2 mL ，加入DEPC水至100 mL，高壓滅菌備用。6. 使用時(shí)先加1020 µg（就是12 µL）到核酸（RNA、DNA均可）溶液中，之后再加相應(yīng)的鹽溶液和異丙醇進(jìn)行沉淀。對于20 nt以上的片段，號稱可以無損回收pg級的核酸。二、10×MOPS （0.2 M