白血病分子生物學朱勇梅3

1、白血病分子生物學白血病分子生物學白血病分子生物學白血病分子生物學白血病的分子機制白血病的分子機制白血病的分子檢測白血病的分子檢測白血病分子檢測的臨床應用白血病分子檢測的臨床應用白血病的分子機制白血病的分子機制基因基因(gene)：合成有功能的蛋白質多肽鏈或合成有功能的蛋白質多肽鏈或RNA所所必需的全部核酸序列。必需的全部核酸序列。癌基因癌基因(oncogene)：細胞或病毒中存在的，能誘導細胞或病毒中存在的，能誘導正常細胞轉化并使之獲得新生物特征的基因。正常細胞轉化并使之獲得新生物特征的基因。癌基因活化的方式：癌基因活化的方式： 點突變點突變 染色體重排染色體重排 基因擴增基因擴增抑癌基因抑癌

2、基因(tumor suppressor genes)：指一類基因，指一類基因，其產物對細胞生長增殖起負調控的作用，并能潛在抑其產物對細胞生長增殖起負調控的作用，并能潛在抑制細胞的惡變。制細胞的惡變。 白血病的分子機制白血病的分子機制白血病的分子機制白血病的分子機制增殖增殖過度過度分化分化阻斷阻斷凋亡凋亡受抑受抑“二次打擊二次打擊”學說學說D.Gary Gilliland Best Practice & Research Clinical Haematology.2003;16:409-417白血病的分子檢測白血病的分子檢測Southern blotNorthern blotWester

3、n blotFISHPCR測序測序芯片芯片白血病的分子檢測白血病的分子檢測PCR反應原理反應原理N = N0 x (1+E)n N：擴增子數(shù)量擴增子數(shù)量N0：起始模板數(shù)量起始模板數(shù)量E：擴增效率擴增效率n：循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù)白血病的分子檢測白血病的分子檢測PCR理論方程理論方程白血病的分子檢測白血病的分子檢測PCR方法優(yōu)點方法優(yōu)點 快速快速 靈敏靈敏 特異特異PCR方法缺點方法缺點 假陽性假陽性 假陰性假陰性白血病的分子檢測白血病的分子檢測PCR：僅適用于染色體斷裂點叢集于相對小僅適用于染色體斷裂點叢集于相對小的范圍內（的范圍內（22kbkb），），如如T-ALL中中SIL-TAL1。 RT-PCR

4、：可用于染色體可用于染色體斷裂點跨越很大的斷裂點跨越很大的區(qū)域的融合基因。區(qū)域的融合基因。 巢式巢式RT-PCR：可顯著提高反應的特異性，可顯著提高反應的特異性，增加擴增效率。增加擴增效率。RQ-PCR：可定量擴增產物?？啥繑U增產物。白血病的分子檢測白血病的分子檢測RQ-PCR（Real-time Quantitative PCR） 熒光標記擴增產物熒光標記擴增產物 熒光標記熒光標記引物引物 特異性熒光標記特異性熒光標記探針探針 TaqMan探針、分子信標、雜交雙探針探針、分子信標、雜交雙探針 熒光染料直接結合熒光染料直接結合擴增產物擴增產物 SYBR Green I與與DNA雙鏈結合雙鏈結

5、合 動態(tài)監(jiān)測熒光信號變化動態(tài)監(jiān)測熒光信號變化TaqMan探針法探針法特異性高特異性高多重基因定量多重基因定量成本較高成本較高SYBR Green I 法法成本低成本低最適合初步篩查最適合初步篩查熔解曲線功能熔解曲線功能無法多重檢測無法多重檢測無模板特異性無模板特異性靈敏度低靈敏度低白血病的分子檢測白血病的分子檢測CT值：熒光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長值：熒光信號有統(tǒng)計學意義顯著增長（穿過閾值線）時的循環(huán)次數(shù)（穿過閾值線）時的循環(huán)次數(shù)CT值與起始模板量成反比值與起始模板量成反比白血病的分子檢測白血病的分子檢測RQ-PCR的檢測系統(tǒng)：的檢測系統(tǒng)：該系統(tǒng)內置了該系統(tǒng)內置了96孔孔PCR儀，且在每個反應

6、孔上儀，且在每個反應孔上均有一個監(jiān)測探頭用于檢測均有一個監(jiān)測探頭用于檢測PCR反應管中的熒反應管中的熒光強度。平均每光強度。平均每8-12秒就檢測一次，以達到實秒就檢測一次，以達到實時檢測的目的。時檢測的目的。系統(tǒng)中的電腦系統(tǒng)同時不斷地分析來自檢測系系統(tǒng)中的電腦系統(tǒng)同時不斷地分析來自檢測系統(tǒng)的信息，不斷計算每個反應管中的熒光強度，統(tǒng)的信息，不斷計算每個反應管中的熒光強度，并最終得到并最終得到CT值。值。該系統(tǒng)可以根據(jù)標準品的該系統(tǒng)可以根據(jù)標準品的CT值和拷貝數(shù)自動繪值和拷貝數(shù)自動繪制標準曲線，并計算未知樣品中的目的基因拷制標準曲線，并計算未知樣品中的目的基因拷貝數(shù)。貝數(shù)。白血病的分子檢測白血病

7、的分子檢測RQ-PCR方法優(yōu)點：方法優(yōu)點： 靈敏而特異靈敏而特異 起點定量起點定量 閉管化學（污染的風險低）閉管化學（污染的風險低） 沒有沒有PCR后處理（無需走膠，拍照等）后處理（無需走膠，拍照等） 高度自動化高度自動化 定性：單數(shù)據(jù)點測定定性：單數(shù)據(jù)點測定 定量：多數(shù)據(jù)點測定定量：多數(shù)據(jù)點測定 能做基因分型及能做基因分型及SNP鑒定鑒定RQ-PCR的操作流程的操作流程從細胞或組織中抽提從細胞或組織中抽提DNA或或RNA用用PCR或或RT-PCR擴增特異片段擴增特異片段 將將PCR產物克隆到合適的載體上產物克隆到合適的載體上純化，定量和系列稀釋質粒純化，定量和系列稀釋質粒DNA或或RNA 體

8、外轉錄成體外轉錄成RNA片段（僅用于片段（僅用于RNA樣品）樣品）構建標準曲線（構建標準曲線（CT lgcopy）樣品的定量檢測樣品的定量檢測校正樣品基因拷貝數(shù)校正樣品基因拷貝數(shù)白血病分子檢測的臨床應用白血病分子檢測的臨床應用白血病的分子生物學檢查對白血病診斷分白血病的分子生物學檢查對白血病診斷分型及預后判斷有以下幾方面意義：型及預后判斷有以下幾方面意義： 補充補充MIC檢查的不足檢查的不足 發(fā)現(xiàn)新的亞型發(fā)現(xiàn)新的亞型 監(jiān)測白血病的微小殘留病灶（監(jiān)測白血病的微小殘留病灶（MRD） 為研究白血病的發(fā)病機制打下基礎為研究白血病的發(fā)病機制打下基礎 白血病分子檢測的臨床應用白血病分子檢測的臨床應用 PC

9、R方法檢測方法檢測MRD常用的分子標志常用的分子標志 AML1-ETOt(8;21)(q22;q22) 68%原發(fā)性原發(fā)性AML，在在M2中的陽性率為中的陽性率為2040%，在，在M2b中陽性率為中陽性率為90% 少見于少見于M4和和M1，極少見于極少見于MDS和骨髓增生綜和骨髓增生綜合癥合癥 AML1-ETO+白血病細胞有一定程度的分化能白血病細胞有一定程度的分化能力，能分化至較成熟的嗜中性粒細胞和嗜酸性力，能分化至較成熟的嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞，且對化療反應較敏感粒細胞，且對化療反應較敏感 AML1-ETO+患者對大劑量阿糖胞苷治療效果患者對大劑量阿糖胞苷治療效果好，具有較高的緩解率，

10、無病生存期長，預后好，具有較高的緩解率，無病生存期長，預后較其他較其他AML亞型（亞型（M3除外）好除外）好 AML1-ETO對初發(fā)患者進行對初發(fā)患者進行t(8;21)和和AML1-ETO融融合基因的檢測對其預后判斷及治療方案合基因的檢測對其預后判斷及治療方案的制定相當重要的制定相當重要 AML1-ETO定性結果不能用于評價患者定性結果不能用于評價患者MRD情況情況 RQ-PCR能實時反映體內能實時反映體內AML1-ETO水水平。連續(xù)定量平。連續(xù)定量AML1-ETO轉錄本水平可轉錄本水平可判定有高復發(fā)風險的患者，以便及早治判定有高復發(fā)風險的患者，以便及早治療干預以防血液學復發(fā)療干預以防血液學復

11、發(fā) AML1- 陰性陰性 ETO+C-KIT基因突變基因突變C-KIT為為III型受體酪氨酸激酶家族（還包括型受體酪氨酸激酶家族（還包括c-FMS，PDGFR和和c-KIT）成員之一成員之一AML1-ETO可誘導性表達的轉基因小鼠，并不可誘導性表達的轉基因小鼠，并不導致白血病發(fā)生導致白血病發(fā)生C-KIT突變可見于伴突變可見于伴inv(16)的的M4以及伴以及伴t(8;21)的的M2患者患者26/54例例(48.1%) M2b患者中檢測到患者中檢測到C-KIT基因基因突變突變57例不伴例不伴t(8;21)的其他類型血液腫瘤患者均未的其他類型血液腫瘤患者均未檢測到檢測到C-KIT基因突變基因突變以

12、上結果提示以上結果提示C-KIT突變與突變與M2b密切相關密切相關(R=0.94, P0.01)C-KIT基因突變基因突變C-KIT基因結構基因結構JMC-KIT基因突變基因突變外周血白細胞計數(shù)外周血白細胞計數(shù)C-KIT基因突變基因突變生存曲線生存曲線PML-RARt(15;17)(q22;q21) 98%M3患者患者繼繼t(15;17)之后，又先后發(fā)現(xiàn)之后，又先后發(fā)現(xiàn)4種種M3特異的累及特異的累及RAR的變異性染色體易位：的變異性染色體易位：t(11;17)(q23;q21)，t(5;17)(q35;q21)，t(11;17)(q13;q21)以及以及dup(17)(q21.3;q23)，分

13、別產生分別產生PLZF-RAR，NPM-RAR，NuMA-RAR和和STAT5b-RAR融融合基因合基因臨床上，具有臨床上，具有PLZF-RAR或或STAT5b-RAR融融合基因患者對合基因患者對ATRA治療不敏感，其余三種染治療不敏感，其余三種染色體易位患者經色體易位患者經ATRA治療可獲完全緩解治療可獲完全緩解 PML-RARAPL累及的累及的RAR基因及其伙伴基因結構示意圖基因及其伙伴基因結構示意圖 PML-RAR由于由于PML基因斷裂點基因斷裂點不同產生不同產生3種不同的種不同的PML-RAR異構體異構體 約約55%的的M3患者為患者為L型，型，40%為為S型，型，5%為為V型，且每位

14、患者只表達一種型，且每位患者只表達一種PML-RAR融合蛋白融合蛋白形態(tài)學上形態(tài)學上S型白血病細胞常為低分化的并型白血病細胞常為低分化的并且這些患者可見繼發(fā)細胞遺傳學異常，且這些患者可見繼發(fā)細胞遺傳學異常，V型型APL患者的白血病細胞體外對患者的白血病細胞體外對ATRA的的敏感度低敏感度低 PML-RARRT-PCR檢測檢測PML-RAR是敏感且特異的是敏感且特異的APL診斷方法，還能用于治療后診斷方法，還能用于治療后MRD監(jiān)監(jiān)測。測。PML-RAR陽性提示的分子復發(fā)常陽性提示的分子復發(fā)常早于臨床復發(fā)早于臨床復發(fā)3-63-6個月，為臨床采取進一個月，為臨床采取進一步治療措施提供了保障步治療措施

15、提供了保障 RQ-PCR能有效反映患者在發(fā)病、治療、能有效反映患者在發(fā)病、治療、緩解、復發(fā)整個過程的白血病細胞負荷，緩解、復發(fā)整個過程的白血病細胞負荷，在在MRD監(jiān)測中比監(jiān)測中比RT-PCR具有更高價值具有更高價值 L+ 陰性陰性 S+FLT3基因突變基因突變Fms-related tyrosine kinase 3FLT3為為III型受體酪氨酸激酶家族（還包括型受體酪氨酸激酶家族（還包括c-FMS，PDGFR和和c-KIT）成員之一，該類受成員之一，該類受體因在造血過程中造血細胞的增殖和存活中發(fā)體因在造血過程中造血細胞的增殖和存活中發(fā)揮重要調控作用揮重要調控作用綜合國外各研究報道，綜合國外各

16、研究報道， FLT3-ITD和和D835突變突變在在AML中陽性率分別為中陽性率分別為24%(385/1585)和和7%(30/429)，總陽性率超過，總陽性率超過30%，使其成為，使其成為AML中最普遍發(fā)生突變的靶基因中最普遍發(fā)生突變的靶基因許多臨床研究發(fā)現(xiàn)，許多臨床研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3突變還與臨床預后突變還與臨床預后密切相關，尤對密切相關，尤對60歲以下的歲以下的AML患者，患者，F(xiàn)LT3突變患者預后較差，且可獨立于核型之外突變患者預后較差，且可獨立于核型之外FLT3基因突變基因突變FLT3基因突變基因突變FLT3基因主要突變類型基因主要突變類型FLT3基因突變基因突變mut-FLT3信號通

17、路信號通路FLT3基因突變基因突變外周血白細胞計數(shù)外周血白細胞計數(shù)020406080100120140160 FLT3-ITD- FLT3-ITD+APL患者初發(fā)時外周血WBC計數(shù)(x109)CBF-MYH11inv(16)(p13;q22)及及t(16;16)(p13;q22) 主要見于主要見于M4Eo，10%不伴異常嗜酸細胞不伴異常嗜酸細胞M4，少見于少見于M2CBF-MYH11融合蛋白通過干擾核心結融合蛋白通過干擾核心結合因子（合因子（core binding factor,CBFcore binding factor,CBF）的的轉錄激活作用而致病轉錄激活作用而致病 具有具有CBF-M

18、YH11的患者對化療敏感，的患者對化療敏感，預后較好，故提高檢測率尤具臨床意義預后較好，故提高檢測率尤具臨床意義 CBF-MYH11CBF-MYH11具有多種變異型，其中最具有多種變異型，其中最常見的為常見的為A型，占型，占80%RT-PCR檢測檢測CBF-MYH11進行進行MRD監(jiān)監(jiān)測顯示，大部分患者在完全緩解時測顯示，大部分患者在完全緩解時PCR轉陰，但仍有小部分長期存活者轉陰，但仍有小部分長期存活者PCR仍仍為陽性為陽性最新研究采用最新研究采用RQ-PCR檢測檢測CBF-MYH11轉錄本水平來評價轉錄本水平來評價M4Eo患者患者MRD情況，預示復發(fā)情況，預示復發(fā) NPM基因突變基因突變N

19、ucleophosmin，為核為核-漿穿梭蛋白，調控漿穿梭蛋白，調控p53-ARF通路通路見于見于50%核型正常的核型正常的AML患者，而在伴低?；颊?，而在伴低危/高危核型患者中極少見高危核型患者中極少見主要見于主要見于M4/M5中中第第12號外顯子的插入號外顯子的插入/缺失缺失伴此突變患者伴此突變患者WBC計數(shù)高計數(shù)高目前，此突變的預后價值各研究組報道不一，目前，此突變的預后價值各研究組報道不一，尚待進一步證實尚待進一步證實DEK-CANt(6;9)(p23;q34) 主要見于主要見于M2或或M4，也見于，也見于M1，MDS- -RAEB伴伴DEK-CAN的患者年齡一般較輕，且預后較的患者年

20、齡一般較輕，且預后較差差此類患者進行分子監(jiān)測有助于判斷患者預后，此類患者進行分子監(jiān)測有助于判斷患者預后，調整治療方案調整治療方案 N-RAS基因突變基因突變?yōu)闉镽AS基因家族成員之一，染色體定位于基因家族成員之一，染色體定位于1p32.2。具有具有GTP/GDP結合和結合和GTPase活性，活性，調控正常細胞的生長調控正常細胞的生長此基因突變存在于此基因突變存在于11-30%AML突變熱點位于突變熱點位于codon12,13和和61在在inv(16)/t(16;16),inv(3)/t(3;3)中突變率較高，中突變率較高，而在而在t(15;17)中低中低伴此突變患者外周血伴此突變患者外周血WB

21、C計數(shù)低計數(shù)低該突變預后意義尚不明該突變預后意義尚不明WT-1基因高表達基因高表達Wilms tumor 1是無特異分子異常的急性白血病患者理是無特異分子異常的急性白血病患者理想的想的MRD檢測指標檢測指標伴此基因高表達者預后差，且表達程度伴此基因高表達者預后差，且表達程度與預后相關與預后相關BCR-ABLt(9;22)(q34;q11) 1530%成人成人ALL及及35%兒童兒童ALL 9號染色體的斷裂點與號染色體的斷裂點與CML相同，但相同，但22號染色號染色體斷裂點具有異質性體斷裂點具有異質性 此融合蛋白此融合蛋白p190刺激細胞增殖的能力比刺激細胞增殖的能力比p210要要強。在轉基因試

22、驗中觀察到強。在轉基因試驗中觀察到p190誘發(fā)的白血病誘發(fā)的白血病具有起病早、發(fā)展快和惡性程度高的特點具有起病早、發(fā)展快和惡性程度高的特點BCR-ABL+ALL患者預后差，患者預后差，5年存活率年存活率20%，因此這些患者在緩解后需進行骨髓移植治療因此這些患者在緩解后需進行骨髓移植治療 BCR-ABL對于自體或異體移植對于自體或異體移植ALL患者，移植前患者，移植前后后BCR-ABL的有無以及的有無以及BCR-ABL的轉錄的轉錄本類型與預后有關本類型與預后有關 e1a2+ 陰性陰性E2A-PBX1t(1;19)(q23;p13) 56%兒童兒童ALL和和3%成人成人ALL 此類患者具有高的白細

23、胞計數(shù)，高的血清乳酸此類患者具有高的白細胞計數(shù)，高的血清乳酸脫氫酶及中樞神經系統(tǒng)癥狀，預后差，平均無脫氫酶及中樞神經系統(tǒng)癥狀，預后差，平均無病生存期（病生存期（DFS）僅僅6個月，個月，3年年DFS為為20%，需給予這些患者強化治療才能獲得較好的預后需給予這些患者強化治療才能獲得較好的預后核型和核型和E2A-PBX1檢測對此類患者的診斷和治檢測對此類患者的診斷和治療方案的選擇至關重要療方案的選擇至關重要E2A-PBX1的預后價值需更多的臨床研究證實的預后價值需更多的臨床研究證實 TEL-AML1t(12;21)(p13;q22) 25%兒童兒童ALL，是兒童是兒童ALL中最常見的分子異中最常見

24、的分子異常常 目前為止尚未在目前為止尚未在T-ALL，AML或或NHL中發(fā)現(xiàn)中發(fā)現(xiàn)t(12;21)，在嬰兒白血病中極少報道，在成人在嬰兒白血病中極少報道，在成人白血病患者中頻率很低（白血病患者中頻率很低（2%）此類患者發(fā)病年齡小（此類患者發(fā)病年齡?。?歲歲10歲），歲），WBC計計數(shù)低（數(shù)低（50 000/L），），免疫表型為前免疫表型為前B-ALL此類患者對治療反應佳，完全緩解時間長，預此類患者對治療反應佳，完全緩解時間長，預后好后好 TEL-AML1由于由于12p和和21q末端在常規(guī)顯帶中很相似，末端在常規(guī)顯帶中很相似，因此常規(guī)細胞遺傳學方法檢出率僅因此常規(guī)細胞遺傳學方法檢出率僅0.05%

25、，需應用需應用FISH或或RT-PCR方法提高檢測陽方法提高檢測陽性率性率TEL基因重排是獨立預后因素，基因重排是獨立預后因素，RT-PCR檢測檢測TEL-AML1融合基因能將低危險度融合基因能將低危險度與高危險度的與高危險度的ALL患者區(qū)分開來。因此患者區(qū)分開來。因此早期檢測早期檢測TEL-AML1融合基因對臨床預融合基因對臨床預后，確定合適的治療方案都有重要意義后，確定合適的治療方案都有重要意義 MLL相關融合基因相關融合基因 累及累及MLL基因的分子異常見于基因的分子異常見于5.2%AML，22%ALL和混合性白血病及某些淋巴瘤，還可和混合性白血病及某些淋巴瘤，還可見于治療相關白血病，尤

26、接受見于治療相關白血病，尤接受topoisomerase II抑制劑治療的患者抑制劑治療的患者 MLL基因涉及五十余種染色體易位，產生不同基因涉及五十余種染色體易位，產生不同的融合蛋白，且每種融合蛋白都與特定的白血的融合蛋白，且每種融合蛋白都與特定的白血病表型相關。最常見的有：病表型相關。最常見的有： t(4;11)(q21;q23) MLL-AF4融合基因融合基因 ALL t(9;11)(p22;q23) MLL-AF9融合基因融合基因 AML t(11;19)(p13;q23) MLL-ENL融合基因融合基因 AML及及ALLMLL相關融合基因相關融合基因至今，至今，MLL相關融合蛋白的致

27、病性還不相關融合蛋白的致病性還不清楚，推測其可能具有雙重作用：清楚，推測其可能具有雙重作用： 融合蛋白可能獲得新的功能，促使融合蛋白可能獲得新的功能，促使細胞轉化細胞轉化 MLL發(fā)生斷裂后，缺失鋅指結構域發(fā)生斷裂后，缺失鋅指結構域的的MLL不能與不能與DNA結合，失去其轉錄活結合，失去其轉錄活化功能，使受化功能，使受MLL調節(jié)的靶基因（調節(jié)的靶基因（HOX基因）表達異常，也影響造血細胞的發(fā)基因）表達異常，也影響造血細胞的發(fā)育育 MLL-AF4t(4;11)(q21;q23)t(4;11)的發(fā)生率在不同年齡段是不同的，在嬰的發(fā)生率在不同年齡段是不同的，在嬰兒兒ALL中最多見，為中最多見，為507

28、0%，而在兒童和成，而在兒童和成人中較低，分別為人中較低，分別為2%和和36%此類患者發(fā)病年齡低（通常此類患者發(fā)病年齡低（通常 90% CML患者患者BCR-ABL融合蛋白（融合蛋白（p210）的酪氨酸蛋白激的酪氨酸蛋白激酶活性較正常酶活性較正常ABL高，可能是高，可能是BCR對對ABL激酶激酶活性調節(jié)區(qū)的作用所致活性調節(jié)區(qū)的作用所致由于由于5%CML患者為隱匿性患者為隱匿性Ph染色體，因此染色體，因此無無Ph染色體染色體CML患者還需使用更靈敏的分子患者還需使用更靈敏的分子檢測手段如檢測手段如FISH或或RT-PCR檢測檢測BCR-ABL融合融合基因基因RT-PCR還能區(qū)分還能區(qū)分e1-a2

29、和和b2-a2/b3-a2二種二種BCR-ABL轉錄本，從而區(qū)分轉錄本，從而區(qū)分ALL患者與患者與CML急淋急淋變患者，進而分別對兩種不同患者采用不同的變患者，進而分別對兩種不同患者采用不同的治療方案治療方案BCR-ABL巢式巢式RT-PCR檢測檢測BCR-ABL融合基因用融合基因用于于CML移植患者移植后移植患者移植后MRD監(jiān)測?？稍诒O(jiān)測?？稍诨颊哐簩W復發(fā)前的患者血液學復發(fā)前的624個月骨髓檢測個月骨髓檢測就呈陽性。就呈陽性。 RQ-PCR還能動態(tài)觀察患者治療后還能動態(tài)觀察患者治療后BCR-ABL轉錄本水平變化情況，反映療效。轉錄本水平變化情況，反映療效。 b3a2+ b2a2+ 陰性陰性GATA2基因突變基因突變調控早期造血干細胞增殖分化的轉錄因子，維調控早期造血干細胞增殖分化的轉錄因子，維持造血干祖細胞的增殖和自我更新能力持造血干祖細胞的增殖和自我更新能力CML急變患者中新發(fā)現(xiàn)急變患者中新發(fā)現(xiàn)GATA2基因突變，基因突變， 而而CML慢性期、加速期，慢性期、加速期，AML（M1-M7），），MDS，ALL，CLL，淋巴瘤和骨髓瘤患者，淋巴瘤和骨髓瘤患者，以及