(完整word版)柱離心法純化質(zhì)粒DNA

1、柱離心法純化質(zhì)粒DNA一、實驗?zāi)康?#183;學習柱離心法純化質(zhì)粒DNA二、實驗原理·離心柱結(jié)構(gòu)：特殊硅基質(zhì)吸附材料，特異性吸附DNA ，而 RNA 與蛋白質(zhì)穿過。在正常情況下， 核酸表面覆蓋了一層由水分子組成的親水薄膜，以維持其水溶性。 高濃度鹽離子的加入破壞了核酸表面親水薄膜的相對有序排列，形成了疏水環(huán)境。 在此環(huán)境中， 核酸與硅膠膜能有效結(jié)合，而蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物和其他污染物則不能結(jié)合。·堿變性抽提的原理是在 pH 高于 12.6 的堿性條件下，染色體DNA 的氫鍵斷裂，破壞了堿基配對，導致雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，但閉環(huán)的質(zhì)粒DNA 鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。

2、當 pH 調(diào)至中性時，質(zhì)粒DNA 鏈迅速恢復(fù)到原來構(gòu)型，仍保存于溶液中。而變性的染色體 DNA 不能再復(fù)性，通過離心，隨不穩(wěn)定的大分子RNA 、蛋白質(zhì) -SDS 復(fù)合物等一起沉淀下來，使兩者得以分離。三、實驗器材與試劑·試劑盒自帶溶液、·漂洗液、結(jié)合緩沖液、洗脫緩沖液、TE buffer·器材：吸附柱、取液槍、離心機 、低壓 電泳儀 、水平電泳槽、紫外透射儀四、實驗步驟1.培養(yǎng)細菌： 將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml 含有相應(yīng) 抗生素 的液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng) 1216 小時 ;2.取液體培養(yǎng)液 3ml （ 1.5mlX2) 于 Eppendorf 加入 1

3、00ml 溶液 I ，充分混勻 ;置冰上 ;管中， 10000r/min離心1min ，去掉上清液，3.加入 150ml溶液 II，加蓋顛倒6-7 次使之混勻，冰上放置1 2min;4.加入 150 m l 溶液 III，加蓋后顛倒6-7 次混勻，冰上放置5min;5.用臺式高速 離心機 ， 12000r/min離心 10min;6.吸附柱中加入420ul結(jié)合緩沖液，將步驟5 中的上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，蓋上收集管的蓋子，混勻，12000r/min離心 1min7.取下吸附柱， 倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600ul漂洗液 , 靜置 1 min ， 12000r/min

4、 離心 30 s；8.重復(fù)步驟7 一次9.取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，12000r/min離心 2min10. 吸附柱放入一個新的 1.5ML 室溫放置 3 5 分鐘。蓋好蓋子離心管 ，在吸附柱的中央加40ul12000rpm離心 1 分鐘，收集質(zhì)粒洗脫緩沖液或DNA 溶液。TE buffer,11. 取 5ul 電泳檢查， (100ml 凝膠加入5ul 染料 )注：加樣時要排出槍頭中的空氣，以免攪動液面12. 電泳結(jié)束后（溴酚藍走到膠的正中位置附近），將凝膠拿到成像系統(tǒng)中拍照。五、實驗結(jié)果·由近到遠各條帶分別顯示：環(huán)狀DNA 、線性 DNA 、超螺旋 DN

5、A 、 RNA但是 DNA 各條帶顯示并不十分清晰，也不是全部都可以看到，這可能與加樣時的操作未能使得所有樣都進入溝槽中有關(guān)。注：用柱離心法純化的質(zhì)粒DNA 沒有 RNA 的顯示·原因分析：特殊硅基質(zhì)吸附材料可以特異地吸附DNA ， RNA 則會穿過，被基本去除，而實驗一的離心法在吸取水層時或多或少會吸取到下面的有機層，使得最后得到的物質(zhì)中有RNA 的存在。六、實驗討論·分離純化質(zhì)粒DNA 的方法很多，通常是利用它與細菌染色體DNA 在特性和構(gòu)型上的不同而進行的。目前常用的有堿變性法、煮沸裂解法、羥基磷灰石柱層析法、酸酚法、兩相法以及氯化艷 -溴化乙錠密度梯度離心法。這些方

6、法各有特點， 但它們都含有以下三個基本步驟，即：培養(yǎng)菌體和擴增質(zhì)粒；收獲和裂解菌體；純化質(zhì)粒DNA 。·在細菌細胞內(nèi),共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在.在提取質(zhì)粒過程中,除了超螺旋DNA外 ,還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA.如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA(OpencircularDNA, 簡稱ocDNA); 如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(LinearDNA).當提取的質(zhì)粒DNA電泳時,同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。·該方法抽提質(zhì)粒主要的試

7、劑為溶液I,II 和 III, 其在抽提質(zhì)粒DNA 中的作用如下 :溶液 I: 由葡萄糖 ,EDTA ,Tris Cl 組成 .葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,減少抽提過程中的機械剪切作用 ,防止破壞質(zhì)粒DNA; EDTA 的作用是絡(luò)和掉Mg 2+等二價金屬離子, 防止 DNA 酶對質(zhì)粒分子的降解作用;Tris Cl 能使溶菌液維持溶菌作用的最適pH 范圍。溶液 II:由 SDS 與 NaOH 組成。 SDS 的作用是解聚 核蛋白 并與蛋白質(zhì)分子結(jié)合使之變性;NaOH(pH>12) 的作用是破壞氫鍵,使 DNA 分子變性。溶液 III:由 KAc 與 HAc 組成 ,是 pH 值為 5.5 的高 鹽溶液 .能中和溶液II 的堿性 ,使染色體DNA 復(fù)性而發(fā)生纏繞并使質(zhì)粒DN