大鼠大腦皮層星形膠質細胞原代培養(yǎng)及傳代

1、大鼠大腦皮層星形膠質細胞原代培養(yǎng)及傳代南京軍區(qū)總院神經內科實驗室 許麗麗 2012-12-01一、試劑1) Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2) DMEM（Invitrogen,11995-065）3) FBS（Invitroge,10099-141）64) HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）5) 0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）6) DPBS（HyClone，SH30028.01B）7) dd H2O8) 75酒精二、器械1) 手術器械：眼科剪x2、

2、眼科鑷直、彎各x2、顯微鑷x2（金鐘，WA3050）、顯微剪x12) 100 ml小燒杯3) 200目不銹鋼篩4) 細胞計數器（求精）5) 50ml離心管（Corning，430828）、15ml離心管（Corning，430790）6) 25ml培養(yǎng)瓶（Corning，430639）或75ml培養(yǎng)瓶（Corning，430641）7) 100ml玻璃瓶（蜀牛）8) 直徑為60mm的培養(yǎng)皿（LabServ,310109010）9) 3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）10) 過濾器（Millex-GP, SLGP033RB）11) 注射器：50ml、5ml各 112) Pip

3、ette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 將解剖器械、槍頭高溫高壓消毒15分鐘，消毒結束后放入烘箱中烘干待第二天使用。1.2 打開操作臺紫外線燈消毒30分鐘。2、包被培養(yǎng)板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作臺、移液槍，點燃酒精燈。2.2 取PLL，用DPBS將其稀釋至100g/ml。2.3 以PLL包被培養(yǎng)瓶，量以覆蓋培養(yǎng)瓶底面為宜。25ml培養(yǎng)瓶：3ml；75ml培養(yǎng)瓶：8ml。過夜。3、配置培養(yǎng)基、消化酶3.1 DMEM with 10% FBSFBS：DMEM=1：10取FBS 8ml、DMEM 80ml加入100ml高溫高壓過的玻璃瓶中

4、。3.2 0.125胰酶取0.25Trypsin-EDTA,用DPBS稀釋2倍。將配置好的培養(yǎng)基、消化酶放入4°C冰箱中，待第二天使用。4、消毒操作臺使用完畢后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作臺、移液槍，關閉酒精燈，打開紫外線燈消毒30分鐘。Day 21、消毒打開操作臺紫外線燈消毒30分鐘。2、洗板用ddH2O洗滌3 x 5 min，放入培養(yǎng)箱中晾干。3、解剖新生鼠（所有操作在冰袋上進行）3.1 將出生24小時之內的新生鼠在100ml燒杯中用75%酒精浸泡5min。3.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作臺、移液槍，點燃酒精燈。3.3 取2個培養(yǎng)皿，內乘HBSS，放置在冰袋上。3.4 剪去新生鼠

5、的頭，將頭放入一個培養(yǎng)皿中。3.5 用眼科剪把新生鼠頭骨剪開，取出腦組織，將腦組織放入另一乘HBSS的培養(yǎng)皿中（將所有的新生鼠都同樣處理）。3.6 用兩支顯微鑷分離腦膜，盡可能的去掉所有的血管和血管膜，將分離好的腦組織放入另一新的內乘HBSS的培養(yǎng)皿中。3.7 將分離好的腦膜用顯微剪剪碎腦組織，約1mm3。4、接種細胞4.1 用移液管將剪碎的腦組織移入兩個15 ml離心管中。4.2 每支離心管加入3 ml 0.125胰酶，搖勻，37消化15分鐘（為增加接觸面積消化更充分可將離心管平放，也可以用60 mm培養(yǎng)皿消化。）4.3 消化期間整理操作臺。4.4 消化15min后，用移液管除去胰酶，每支離

6、心管加入2 ml 10 FBS/DMEM終止消化。4.5 吹打：用1 ml槍頭，吹打40次，靜止2分鐘，將上面液體移入一新的15ml離心管中。下面沉淀的細胞團塊不要丟棄，加入1-1.5ml10 FBS/DMEM吹打20次，重復上面的步驟。一共這樣分次吹打3次。3次之后如果還有團塊在下面，果斷丟棄。（吹打時候要注意，切忌過快，要緩慢吹打。吸入時候要很緩慢，吹出的時候可以略快，但是也要緩慢。）4.6 過篩網至60 mm培養(yǎng)皿中。4.7 將培養(yǎng)皿中液體移入2支15 ml離心管中。4.8 離心：800g/min,5min。4.9 棄上清，沉淀的細胞加10FBS/DMEM 3ml重懸，輕柔吹打100次（

7、具體吹打次數據細胞計數時看到的情況而定，若看到大量細胞團，應加大吹打次數）。4.10 用細胞計數板計數：細胞濃度 = (4個大格細胞總數/4) × 104 /ml4.11 調濃度，接種。接種后搖晃培養(yǎng)板搖勻細胞（注意不要圈圈搖晃，圈圈搖晃會導致神經元都集中到培養(yǎng)板的孔中間，導致濃度不均，生長不均勻。要左右平行翻轉角度，然后前后平行翻轉角度）。具體細胞接種數值：培養(yǎng)液體積（ml/瓶）細胞密度（個/ml）總細胞數（個/瓶）25cm2培養(yǎng)瓶4ml1x1064x10675 cm2培養(yǎng)瓶15ml1x1066-8x1065、消毒實驗結束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作臺、移液槍，關閉酒精

8、燈，打開紫外線燈消毒30分鐘。6、換液細胞種植成功后24小時全量換液，以后每天觀察細胞生長狀態(tài)，每 3天半量換液。注意：換液前要將10%FBS/DMEM放入37細胞培養(yǎng)箱中預熱半小時。7、傳代7.1待細胞長到第10天或看到細胞細胞爬滿培養(yǎng)瓶的90%左右時，在37恒溫搖床200g/min震蕩12-14小時，全量換液。7.2震蕩過后，棄培養(yǎng)基，DPBS洗滌2-3次，加入適量0.25%胰酶，37消化1-3min（以鏡下看到細胞突觸回縮為最佳）。7.3加入2ml培養(yǎng)基中和胰酶，用移液管輕輕吹打細胞壁，使貼壁細胞脫落。7.4將培養(yǎng)基移入15ml離心管中，200g/min離心5min，棄上清。7.5加入新的培養(yǎng)基