沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測-檢驗科PCR室作業(yè)書

1、【實用】檢驗科SO我件沙眼衣原體核酸擴(kuò)增熒光檢測目的：保證CTDNA僉測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。適用范圍：CTDNA的TaqMan熒光定量檢測，標(biāo)本類型為分泌物。負(fù)責(zé)人：操作人：原理：本試劑盒用一對沙眼衣原體特異引物和一條沙眼衣原體特異性 熒光探針，PCR反應(yīng)液，耐熱DNA聚合酶（Taq酶），四種核甘酸單 體（dNTP§等成分，再用PCR#外擴(kuò)增法檢測沙眼衣原體 DNA。 性能參數(shù)：檢出低值 25基因拷貝/ml。標(biāo)本要求：（1）標(biāo)本類型：分泌物。（2）標(biāo)本采集：見標(biāo)本采集手冊。（3）標(biāo)本儲存和運輸：室溫放置不超過 8小時，4-8 C不超過72小 時，-20C保存期6個月，應(yīng)避免反復(fù)凍融。室溫

2、運輸。（4）標(biāo)本拒收狀態(tài)：細(xì)菌污染標(biāo)本不能作測定。容器和添加劑類型：無菌離心管和無菌試管。所需設(shè)備：ABIGeneAmp5700臺式高速離心機(jī)、混勻器、冰箱（4C、-20C）、生物安全柜、紫外燈試劑：DNA提取液（ 500p l/管）2管；CT-PC反應(yīng)液（未貼標(biāo)簽管） 20管；陽性定量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（1X108基因拷貝/ml） （50 口/管）1管; 陰性質(zhì)控品（250 口/管）1管。校準(zhǔn)程序（計量學(xué)溯源性）：送XXX市計量檢測所校準(zhǔn)。程序步驟：11.1 標(biāo)本采集、保存和運送男性：取尿道分泌物或細(xì)小棉拭子伸入快尿道約24cm,略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜）。將分泌物或棉拭子置入無菌玻璃管，用無

3、 菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。女性：陰道一用無菌生理鹽水棉球洗去宮頸外分泌物， 再用無菌棉拭 子插入宮頸內(nèi)，停5秒鐘后旋動棉拭采取宮頸分泌物， 將棉拭子置入 無菌玻璃管，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。尿道一用無菌生理鹽水棉球洗凈尿道口， 再用無菌棉拭子插入尿道約 2cm,略捻拭子取出分泌物（應(yīng)略帶黏膜）。將棉拭子置入無菌玻璃 管，用無菌棉球?qū)⒃嚬苋o后，密閉送檢。標(biāo)本可立即用于測試，也可保存于-20C待測，存期為6個月。標(biāo) 本運送應(yīng)米用0 C冰壺。11.2 標(biāo)本及對照標(biāo)準(zhǔn)品的處理標(biāo)本試管中加入1ml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，吸取液體轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中（如分泌物較多，只取 0.2ml

4、） 12000rpm離心5分鐘. 沉淀加無菌生理鹽水1ml打勻,12000rpm離心5分鐘，再重復(fù)洗滌一次. 沉淀直接加50ulDNA提取液充分混勻，（提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì)， 取樣時需用加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取 或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去 一截。）沸水浴10分鐘（誤差不超過1分鐘），轉(zhuǎn)至4c靜置6-8小時 以保證充分裂解。12, 000rpm離心2分鐘，取上清液2ul做PCR反 應(yīng)。另取陰陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品各 50ul加等量DNA提取液打勻，沸水浴 10分鐘后同上處理。11.3 GeneAmp5700操作取單管單人份PCR5應(yīng)管若干管

5、，直接加入處理后樣品（或陰陽性質(zhì) 控標(biāo)準(zhǔn)品）2ul, 6000rpm離心數(shù)秒。將各反應(yīng)管放入 PCR儀，按下 列條件擴(kuò)增：ABIGeneAmp5700的循環(huán)條件：93 c 2分鐘預(yù)變性，然后按93 C 45秒 55c60秒，先做10個循環(huán)，最后93C 30秒55c 45秒，做30個循 環(huán)。所有設(shè)置全部完成后保存文件，最后運行程序。11.4 結(jié)果分析條件的設(shè)定ABIGeneAmp5700的條件設(shè)置：反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) baseline 的 start 值（24）,stop 值（79）以及 Threshold 值,使陰性質(zhì)控品Ct值為30,臨界陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為2224,強(qiáng)陽 性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品Ct值為1820最后記錄儀器自動分析計算出的 Ct值. 質(zhì)量控制程序：陰性質(zhì)控品：全部陰性陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品：全部陽性I r | 三 0.97（correlation 數(shù)值介于-0.97-1）;108 至 104 基因拷貝 /ml 的陽性標(biāo)準(zhǔn)品檢測的定量值與理論值相比誤差小于士300%干擾：標(biāo)本污染。生物參考區(qū)間：正常人樣本為陰性或 0基因拷貝/ml?；颊邫z驗結(jié)果的可報告區(qū)間：Ct值40,實驗1例:的CTDNA含量（基 因拷貝數(shù)/ml） =M; Ct值=40,樣品CTDNA含量25基因拷貝/ml