PCR技術(shù)的種類及其應(yīng)用

1、PCR 技術(shù)的種類及其應(yīng)用1 PCR 技術(shù)的基本原理PCR技術(shù)是在模板DNA、 引物和四種dNTP等存在的條件下,依賴于DNA聚合酶(Taq酶)的酶促合成反應(yīng)。其具體反應(yīng)分三步：變性、退火、聚合。以上三步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物DNA 又可以作為下一個(gè)循環(huán)模板，數(shù)小時(shí)后，介于兩個(gè)引物之間的目的 DNA 得到了大量的復(fù)制，經(jīng) 2530 次循環(huán) DNA 數(shù)量可達(dá) 2X1067拷貝數(shù)。2 PCR 技術(shù)的種類2.1 反向 PCR(InversePCR,IPCR)技術(shù)原理：反向 PCR 是克隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法.主要原理是用一種在已知序列中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組 I)NA.后酶切片段自

2、身環(huán)化.以環(huán)化的 DNA 作為模板，用一對(duì)與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的 DNA 片段，大小取決于上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼 DNA 序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板 DNA,再通過反向 PCR 獲得未知片段。該方法的不足是：需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的 DNA 片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶 DNA。大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在 YAC 或 Cosmid 中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向 PCR 得到的探針

3、就有可能與多個(gè)基因序列雜交。2.2 錨定 PCR(AnchoredPCR,APCR)技術(shù)用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄 cDNA3-末端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì) tcDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，稱為 APCR。應(yīng)用：它可用于擴(kuò)增未知或全知序列，如未知 cDNA 的制備及低豐度 cDNA 文庫的構(gòu)建。2.3 不對(duì)稱 PCR(asymmetricPCR)技術(shù)兩種引物濃度比例相差較大的 PCR 技術(shù)稱不對(duì)稱 PCR。在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度，常用50100T 比例。在最初的 1015 個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈 DNA,但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后高濃度引物介導(dǎo)的 PCR 反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生大量單鏈

4、 DNA。應(yīng)用：可制備單鏈 DNA 片段用于序列分析或核酸雜交的探針。2.4 反轉(zhuǎn)錄 PCR(reversetranscription,RT-PCR)技術(shù)當(dāng)擴(kuò)增模板為 RNA 時(shí)，需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 才能進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR 應(yīng)用非常廣泛，無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗(yàn)等都經(jīng)常采用。2.5 修飾引物 PCR 技術(shù)為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的，如定向克隆、定點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等，可在引物的 5-端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子及序列分析結(jié)合位點(diǎn)等。2.6 巢式 PCR(NESTPCR)技術(shù)先用一對(duì)靶序列的外引物擴(kuò)增以提高模板量，然后再用一對(duì)內(nèi)引物擴(kuò)增以得到特異的 PCR

5、 帶，此為巢式 PCR。若用一條外引物作內(nèi)引物則稱之為半巢式 PCR。為減少巢式 PCR 的操作步驟可將外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物長些，且用量較少，同時(shí)在第一次 PCR 時(shí)采用較高的退火溫度而第二次采用較低的退火溫度，這樣在第一次 PCR 時(shí)，由于較高退火溫度下內(nèi)引物不能與模板結(jié)合，故只有外引物擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)過若干次循環(huán)，待外引物基本消耗盡，無需取出第一次 PCR 產(chǎn)物，只需降低退火即可直接進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。這不僅減少操作步驟，同時(shí)也降低了交叉污染的機(jī)會(huì)。這種PCR 稱中途進(jìn)退式 PCR(drop-in,drop-outPCR)。上述三種方法主要用于極少量 DNA 模板的擴(kuò)增。2.7 等位基因特異性

6、 PCR(Allele-specificPCR,ASPCR)技術(shù)ASPCR 依賴于引物 3-端的一個(gè)堿基錯(cuò)配，不僅減少多聚酶的延伸效率，而且降低引物-模板復(fù)合物的熱穩(wěn)定性。這樣有點(diǎn)突變的模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增后檢測(cè)不到擴(kuò)增產(chǎn)物，可用于檢測(cè)基因點(diǎn)突變。2.8 單鏈構(gòu)型多態(tài)性 PCR(single-strandconformationalpolymorphismPCR,SSCPPCR)技術(shù)SSCP-PCR 是根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長 DNA 單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測(cè)基因變異。在不含變性劑白中性聚丙烯酰胺凝膠中，單鏈 DNA 遷移率除與 DNA 長度有關(guān)外，更主要取決于 DNA

7、 單鏈所形成的空間構(gòu)象，相同長度的單鏈 DNA 因其順序不同或單個(gè)堿基差異所形成的構(gòu)象就會(huì)不同，PCR 產(chǎn)物經(jīng)變性后進(jìn)行單鏈 DNA 凝膠電泳時(shí),每條單鏈處于一定的位谿靶 DNA 中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個(gè)堿基谿換時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而提示該片段有基因變異存在。9 低嚴(yán)格單鏈特異性引物 PCR(LowstringencysinglespecificprimerPCR,LSSP-PCR)技術(shù) LSSP-PCR 是建立在 PCR 基礎(chǔ)上的又一種新型基因突變檢測(cè)技術(shù)。要求是匕高一低”高濃度的單鏈引物(5-端/3-端引物均可),44.8Lmol,高濃度的 Taq 酶(16Lmol/100ml),

8、低退火溫度(30C),所用的模板必須是純化的 DNA 片段。在這種低嚴(yán)格條件下，引物與模板間發(fā)生不同程度的錯(cuò)配，形成多種大小不同的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)電泳分離后形成不同的帶型。對(duì)同一目的基因而言所形成的帶型是固定的，因而稱之為基因標(biāo)簽”。這是一種檢測(cè)基因突變或進(jìn)行遺傳鑒定的快速敏感方法。復(fù)合 PCR(multiplexPCR)技術(shù)在同一反應(yīng)中用多組引物同時(shí)擴(kuò)增幾種基因片段，如果基因的某一區(qū)段有缺失，則相應(yīng)的電泳譜上這一區(qū)帶就會(huì)消失。復(fù)合 PCR 主要用于同一病原體的分型及同時(shí)檢測(cè)多種病原體、多個(gè)點(diǎn)突變的分子病的診斷。重組 PCR 技術(shù)重組 PCR 技術(shù)是在兩個(gè) PCR 擴(kuò)增體系中，兩對(duì)引物分別由其中之

9、一在其 5-端和 3-端引物上帶上一段互補(bǔ)的序列，混合兩種 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)變性和復(fù)性，兩組 PCR 產(chǎn)物互補(bǔ)序列發(fā)生粘連，其中一條重組雜合鏈能在 PCR 條件下發(fā)生聚合延伸反應(yīng)，產(chǎn)生一個(gè)包含兩個(gè)不同基因的雜合基因。隨機(jī)引物擴(kuò)增技術(shù)(arbitraryprimedPCR,AP-PCR)AP-PCR 技術(shù)通過隨意設(shè)計(jì)或選擇一個(gè)非特異性引物，在 PCR 反應(yīng)體系中，首先在不嚴(yán)格條件下使引物與模板中許多序列通過錯(cuò)配而復(fù)性。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復(fù)性引物存在則可經(jīng) Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生 DNA 片段的擴(kuò)增，經(jīng)一至數(shù)輪不嚴(yán)格條件下的 PCR 循環(huán)后,再于嚴(yán)格條件下進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增

10、的產(chǎn)物經(jīng) DNA 測(cè)序凝膠電泳分離后，經(jīng)放射性自顯影或熒光顯示即可得到 DNA 指紋圖。AP-PCR 用于腫瘤的抑制基因、癌基因的分離；菌種、菌株及不同物種的鑒定；遺傳作圖；不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達(dá)差異等方面的研究。差示 PCR(differentialPCR,d-PCR)技術(shù)d-PCR 可以定量檢測(cè)標(biāo)本靶基因的拷貝數(shù)。它是將目的基因和一個(gè)單拷貝的參照基因谿于一個(gè)試管中進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶，比較兩條區(qū)帶的豐度，或在引物 5-端標(biāo)記上放射性核素后，通過檢測(cè)兩條區(qū)帶放射性強(qiáng)度即可測(cè)出目的基因的拷貝數(shù)。定量 PCR(quantitativePCR,qPCR)技術(shù)

11、qPCR 技術(shù)是用合成的 RNA 作為內(nèi)標(biāo)來檢測(cè) PCR 擴(kuò)增目的 mRNA 的量， 涉及目的 mRNA 和內(nèi)標(biāo)用相同的引物共同擴(kuò)增，但擴(kuò)增出不同大小片段的產(chǎn)物，可容易地電泳分離。一種內(nèi)標(biāo)可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR 可用于研究基因表達(dá)，能提供特定 DNA 基因表達(dá)水平的變化，在癌癥、代謝紊亂及自身免疫性疾病的診斷和分析中很有價(jià)值。競(jìng)爭(zhēng)性 PCR(competitivePCR,c-PCR)技術(shù)c-PCR技術(shù)是競(jìng)爭(zhēng) cDNA模板與目的 cDNA同時(shí)擴(kuò)增， 使用同樣的引物， 但一經(jīng)擴(kuò)增后， 能從這些目的 cDNA區(qū)別開來。通常使用突變性競(jìng)爭(zhēng) cDNA 模板淇序列與目的 cDNA 序列相

12、同，不過模板中僅有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)或缺少內(nèi)切位點(diǎn)，突變性的 cDNA 模板可用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶水解，并用分光計(jì)測(cè)定其濃度。cDNA 目的序列和競(jìng)爭(zhēng)模板相對(duì)應(yīng)的含量，可用澳化乙錠染色，電泳膠直接掃描進(jìn)行測(cè)定，或摻入放射性同位素標(biāo)記的方法測(cè)定。競(jìng)爭(zhēng)模板開始時(shí)的濃度是已知的，則 cDNA 目的序列的最初濃度就能測(cè)定。這種方法能精確測(cè)定 mRNA 中 cDNA 靶序列，可用于幾個(gè)到 10 個(gè)細(xì)胞中mRNA 的定量。半定量 PCR(semiquantitativePCR,sq-PCR)技術(shù)sq-PCR 不同于 c-PCR 的是參照物 ERCC-2 的 PCR 產(chǎn)物與目的 DNA 的 PCR 產(chǎn)物相似，并分別在

13、試管中擴(kuò)增。sq-PCR 的流程為樣品和內(nèi)參照 RNA 分別經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為 cDNA,然后樣品 cDNA 和一系列不同量參照 cDNA 分別在不同管進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝月上電泳拍照，光密度計(jì)掃描，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過回歸公式便可定量表達(dá)的基因量。雖然管與管之間的擴(kuò)增效率難以控制，但由 PCR擴(kuò)增的所有樣本和參照物在不同的實(shí)驗(yàn)中差異很小。這種敏感的技術(shù)可用于其他低表達(dá)的基因士旦原位 PCR(insituPCR)技術(shù)原位 PCR 綜合了 PCR 和原位雜交(Insituhybridization,ISH)的優(yōu)點(diǎn)，是一種在組織切片或細(xì)胞涂片上原位對(duì)特定的 DNA 或 RNA 進(jìn)行擴(kuò)增，再用特異

14、性的探針原位雜交檢測(cè)。原位 PCR 標(biāo)本一般需先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。細(xì)胞膜和核膜有一定的通透性，PCR 擴(kuò)增所需的各種成分可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)或核內(nèi)，在原位對(duì)特定的 DNA 或 RNA 進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由于分子量較大或互相交織，不易透過細(xì)胞膜向外彌散，故保留在原位。這樣就很容易應(yīng)用 ISH 將其檢出，同時(shí)還可對(duì)目的 DNA序列的組織細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。免疫 PCR(immunoPCR)技術(shù)抗原-抗體反應(yīng)與 PCR 技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生了免疫 PCR,是目前為止最為敏感的檢測(cè)方法，理論上可測(cè)到一個(gè)抗原分子的存在。通過用一個(gè)具有對(duì) DNA 和抗體雙重結(jié)合活性的連接分子，使作為標(biāo)記物的 D

15、NA分子特異地結(jié)合到 Ag-Ab 復(fù)合物上，從而形成 Ag-Ab-DNA 復(fù)合物，附著的 DNA 標(biāo)記物可用適宜的引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。特異性 PCR 產(chǎn)物的存在證明 DNA 標(biāo)記物分子特異地附著于 Ag-Ab 復(fù)合物上，進(jìn)而證明有Ag 存在。吳自榮等將 Ab 通過化學(xué)交聯(lián)劑直接連接到分子上構(gòu)建成 Ab-DNA 探針，組成免疫 PCR 檢測(cè)新模式，具有高度靈敏和特異性。免疫 PCR 可對(duì)流行性傳染病(如肝炎、愛滋病等)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)體液中致癌基因和癌基因表達(dá)的微量蛋白等。長片段 PCR(long-PCR)技術(shù)長片段 PCR 是用高質(zhì)量模板 DNA 保證其完整性， 引物應(yīng)較長(2134bp),

16、使用高的退火溫度及錯(cuò)配率更低的酶，將無 3-5外切酶活性的 DNA 聚合酶和低濃度有 3-5外切酶活性的 DNA 聚合酶組合使用，緩沖體系通過提高 Tris 的濃度或改用 Tricine 緩沖液以增強(qiáng)緩沖能力，并調(diào)高體系的 pH。熱循環(huán)參數(shù)總的來說需增加延伸時(shí)間，一般 1kb/min,同時(shí)采用熱啟動(dòng)。長片段 PCR 在限制性片段多態(tài)性及單體型分析、染色體基因步移、DNA 序列分析及基因突變的鑒定等方面得到應(yīng)用。3PCR 技術(shù)的應(yīng)用PCR 技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用PCR 在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用目前，相關(guān)研究人員已經(jīng)利用 PCR 技術(shù)成功建立了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、大豆和玉米的技術(shù)路線，對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆和玉米

17、白檢測(cè)低限分別到達(dá)了 1%和 0.1%。PCR 在研究植作物生長發(fā)育方面的作用植物的生長、發(fā)育、分化和衰老都涉及許多基因的時(shí)空順序表達(dá)，因此研究這個(gè)過程中基因表達(dá)的變化是揭示生長發(fā)育機(jī)理的重要手段。定量 RT-PCR 是研究植物基因表達(dá)水平變化的一項(xiàng)重要技術(shù)。 通過研究不同植物或同意植物不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)水平來揭示植物生長發(fā)育的機(jī)理。PCR 在作物抗病性基因分析、定位中的應(yīng)用在作物病害研究中，作物抗病性及其機(jī)制研究一直是當(dāng)今作物病理學(xué)和作物抗病育種中的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)問題。而我們現(xiàn)在已經(jīng)知道作物對(duì)病原物的抗性是由相對(duì)的基因所控制的，即被廣泛認(rèn)可的基因?qū)蚶碚?。因此，尋找與作物抗病性緊密連鎖的基

18、因標(biāo)記，即將抗病性基因進(jìn)行定位的研究中具有十分重要的理論意義和實(shí)踐意義。利用 PCR 和 RAPD 技術(shù)能夠找到與抗性緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將其進(jìn)行定位。PCR 技術(shù)在食品科學(xué)中的應(yīng)用PCR 技術(shù)在食品科學(xué)中主要用于對(duì)食品中微生物含量的檢測(cè)。應(yīng)用 PCR 技術(shù)，只需數(shù)小時(shí)，就可以用電泳法檢測(cè)出來 0.1mgDNA 中僅含數(shù)個(gè)拷貝的模板序列；用 PCR 擴(kuò)增細(xì)菌中保守的DNA 片段，還可對(duì)那些人工無法培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測(cè)。PCR 技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用目前，全世界利用 PCR 技術(shù)診斷感染性疾病每年達(dá)幾千萬人次，可見其巨大的市場(chǎng)潛力。PCR 技術(shù)主要用于腫瘤、遺傳病和感染性疾病的診斷。PCR 在腫瘤診斷上的應(yīng)用遺傳學(xué)改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因發(fā)生突變、缺失、增加和易位等而導(dǎo)致了細(xì)胞癌變。PCR 不但能有效地檢測(cè)基因的突變、重排、易位等，而且能準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因表達(dá)量，可據(jù)此進(jìn)行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、治