細(xì)菌噬菌體應(yīng)該如何檢測(cè)

1、細(xì)菌噬菌體應(yīng)該如何檢測(cè)噬菌體是一類專性寄生于細(xì)菌和放線菌等微生物的病毒，其個(gè)體形態(tài)極為微小，用常規(guī)微生物”數(shù)法無法測(cè)得其數(shù)量。當(dāng)烈性噬菌體侵染細(xì)菌后會(huì)迅速引發(fā)靈敏細(xì)菌裂解，釋放出大量子代噬菌體，然后它們?cè)贁U(kuò)散和侵染周圍細(xì)胞，最終使含有靈敏菌的懸液由混濁慢慢變清，或在含有靈敏細(xì)菌的平板上顯現(xiàn)肉眼可見的空斑一噬菌斑。了解噬菌體的特性，快速檢查、分離，并進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，對(duì)在生產(chǎn)和科研工作中避免噬菌體的污染具有重要作用。檢樣能夠是發(fā)酵液、空氣、污水、土壤等（至于無法采樣而需檢查的對(duì)象，能夠用無菌水浸濕的棉花涂拭表面作為檢查樣品）。為了易于分離可先經(jīng)增殖培育，使樣品中的噬菌體數(shù)量增加。采納微生物測(cè)定法進(jìn)行

2、噬菌體檢測(cè)，約需12h左右，因此不能及時(shí)判定是不是有噬菌體污染。通過快速檢測(cè)可大致確信是不是有噬菌體污染，以采取必要的防治方法。根據(jù)正常發(fā)酵（培育）液離心后菌體沉淀，上清液蛋白含量很少，加熱后仍然清光;而侵染有噬菌體的發(fā)酵（培育）液經(jīng)離心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，加熱后發(fā)生蛋白質(zhì)變性，因此在光線照射下顯現(xiàn)丁達(dá)爾效應(yīng)而不清克。此法簡(jiǎn)單、快速，對(duì)發(fā)酵液污染噬菌體的判定亦較準(zhǔn)確。但不適于溶源性細(xì)菌及溫合噬菌體的診斷，對(duì)侵染噬菌體較少的一級(jí)種子培育液也往往不適用。噬菌體的效價(jià)即1mL樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數(shù)。效價(jià)的測(cè)定一樣采納雙層瓊脂平板法。由于在含有特異宿主細(xì)菌的瓊脂平板上，

3、一樣一個(gè)噬菌體產(chǎn)生一個(gè)噬菌斑，故可依照必然體積的噬菌體培育液所顯現(xiàn)的噬菌斑數(shù)，計(jì)算出噬菌體的效價(jià)。此法所形成的噬菌斑的形態(tài)、大小較一致，且清楚度高，故計(jì)數(shù)比較準(zhǔn)確，因此被普遍應(yīng)用。檢測(cè)材料1 .菌種靈敏指示菌（大腸桿菌）、大腸桿菌噬菌體（從陰溝或糞池污水中分離）2 .培育基兩倍肉膏蛋白陳培育液，上層肉膏蛋白陳半固體瓊脂培育基（含瓊脂樂試管分裝，每管血），基層肉膏蛋白陳固體瓊脂培育基（含瓊脂2%）,1%蛋白陳水培育基。3 .儀器耗材無菌的試管、培育皿、三角瓶、移液管（一、5mL）,恒溫水浴鍋，離心機(jī)、721分光光度計(jì)等。噬菌體檢測(cè)方式1 .噬菌體的檢測(cè)樣品搜集將23g土樣或5mL水樣（如陰溝污水

4、）放入滅菌三角瓶中，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的靈敏指示菌（大腸桿菌）菌液35mL,再加20mL二倍肉湯蛋白陳培育液。增殖培育30c振蕩培育1218h,使噬菌體增殖。離心分離將上述培育液以3000rpn）離心1520min,取上清液，用，1%蛋白陳水稀釋至10-210-3,用于噬菌體檢查及效價(jià)測(cè)定。生物測(cè)定法雙層瓊脂平板法倒基層瓊脂，融化基層培育基，倒平板（約10mL/皿）待用。倒上層瓊脂融化上層培育基，待融化的上層培育基冷卻至50c左右時(shí)，每管中加入靈敏指示菌(大腸桿菌)菌液，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液，混合后當(dāng)即倒入上層平板攤平。恒溫培育：30c恒溫培育612h觀看結(jié)果。觀看結(jié)果：如有噬菌體，那么在

5、雙層培育基的上層顯現(xiàn)透亮無菌圓形空斑噬菌斑。單層瓊脂平板法省略基層培育基，將上層培育基的瓊脂量增加至2%,融化后冷卻至45c左右,猶如上法加入指示菌和檢樣，混合后迅速倒平板。30c恒溫培育616h后觀看結(jié)果。離心分離加熱法(快速檢查)取大腸桿菌正常培育液和侵染有噬菌體的異樣大腸桿菌培育液，4000rpm離心20min,別離取兩組發(fā)酵液的上清液(Al),一部份于721分光光度計(jì)上測(cè)定0D650光密度值，另外各取5mL上清液于試管中，置水浴中煮沸2min(A2),檢測(cè)A2溶液0D650光密度值，記錄結(jié)果。2 .噬菌體效價(jià)的測(cè)定倒平板將融化后冷卻到45c左右的基層肉膏蛋白陳固體培育基傾倒于11個(gè)無菌

6、培育皿中，每如約傾注10mL培育基，平放，待冷凝后在培育皿底部注明噬菌體稀釋度。稀釋噬菌體按10倍稀釋法，吸取大腸桿菌噬菌體，注入一支裝有蛋白陳水的試管中，即稀釋到10-1,依次稀釋到10-6稀釋度。3 .噬菌體與菌液混合將11支滅菌空試管別離標(biāo)記10-4、10-五、10-6和對(duì)照。別離從10-4、10-5和10-6噬菌體稀釋液中吸取于上述編號(hào)的無菌試管中，每一個(gè)稀釋度平行做三個(gè)管，在另外兩支對(duì)照管中加無菌水，并別離于各管中加入大腸桿菌菌懸液，振蕩試管使菌液與噬菌體液混合均勻，置37水浴中保溫5min,讓噬菌體粒子充分吸附并侵入菌體細(xì)胞。4 .接種上層平板將11支融化并保溫于45c的上層肉膏蛋白陳半固體瓊脂5mL別離加入到含有噬菌體和靈敏菌液的混合管中，迅速搓勻，當(dāng)即倒入相應(yīng)編號(hào)的底層培育基平板表面，邊倒入