免疫沉淀Immunoprecipitation試驗操作方法

1、免疫沉淀（Immunoprecipitation）實驗操作方法實驗原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌蛋白質(zhì)如proteinA/G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白（抗體）FC片段的現(xiàn)象而開發(fā)出來的特異分離富集抗原的方法。目前多用預(yù)先結(jié)合固化在Agarosebeads上的proteinA/G（Agrose-proteinA/G）,使之與抗體結(jié)合，再通過抗體特異性結(jié)合抗原而形成Agrose-proteinA/G、抗體、抗原復(fù)合物，利用Agarosebeads的重量，通過離心即可特異分離富集目的抗原。CopyrightMolecularStati

2、onCtntrfuQjbmM翱higniTrtComplt由事，低.而4*實驗步驟：1 .處理細(xì)胞：依據(jù)實驗?zāi)康模O(shè)計實驗，處理好細(xì)胞模型。一般3X106細(xì)胞/處理（即六孔板一個孔，約200ug總蛋白）。2 .配IP裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制劑，如果蛋白磷酸化水平影響實驗結(jié)果則應(yīng)加入磷酸酶抑制劑。注意抑制劑的要現(xiàn)加現(xiàn)用。3 .收集細(xì)胞：冰上操作，裂解細(xì)胞前用1XPBS（4度）洗1遍，每孔加入200ulIP裂解液，冰上靜置5分鐘后刮下細(xì)胞并收集至EP管中。4 .超聲：強(qiáng)度37%,5秒X4次（程序07）。目的是使細(xì)胞裂解更完全并打斷基因組DNA,但可能會影響蛋白質(zhì)之間的相互

3、作用，進(jìn)行共免疫沉淀實驗時要注意這一點。5 .離心細(xì)胞裂解液：4度10000rpm10分鐘。6 .Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗體對應(yīng)15ulAgrose-proteinA/G（不同公司產(chǎn)品可能不同，注意結(jié)合說明書及實驗結(jié)果考慮），預(yù)清洗細(xì)胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量與結(jié)合抗體的用量一致。取相應(yīng)量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪槍頭）并用500ul1xPBS（4度）洗兩遍，5000rpmx2分鐘，吸掉上清備用。7 .細(xì)胞裂解液預(yù)清洗：為去除非特異作用，細(xì)胞裂解液先用Agrose-proteinA/G預(yù)清洗。轉(zhuǎn)移步驟5離心好的細(xì)胞裂解液

4、上清至步驟6洗好的Agrose-proteinA/G中，4度翻轉(zhuǎn)1小時。8 .抗體和Agrose-proteinA/G預(yù)孵育：為減少游離抗體消耗抗原造成IP效率下降，將抗體和Agrose-proteinA/G進(jìn)行預(yù)孵育。在步驟6洗好的Agrose-proteinA/G中加入200ul含0.1%BSA的IP裂解液及相應(yīng)量的抗體，4度翻轉(zhuǎn)1小時。不同抗體時間可能有不同。9 .抗原抗體孵育：步驟7和8后進(jìn)行離心（5000rpm2分鐘），將預(yù)清洗好的細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到含預(yù)孵育好的抗體和Agrose-proteinA/G的EP管中，4度孵育過夜。10 .洗IP復(fù)合物：步驟9后離心（5000rpm2分鐘），

5、吸掉上清，加入IP裂解液（一般不用加抑制劑）500ul,彈勻后4度搖轉(zhuǎn)5分鐘，重復(fù)6次。最后一次離心后加入3XSDS60ul。11 .WB檢測。附注：IPlysisbuffer50mMPH7.4150mM2mM1mM1%TrisNaCl:EGTAEDTATritonX-100磷酸酶抑制劑：Pyrophosphate2.5mMGlycerolphosphate1mMNa3VO41mM蛋白酶抑制劑：PMSF1mMLeupeptin1ug/mlAprotinin5ug/mlIPlysisbufferReagentFinalconcentrationQuantityTris-base(FW121.1)50mM0.6055gNaCl(FW58.44)150mM0.8766gEDTA(0.5M)1mM0.2mlTriton1%1mlHCl(FW36.46)adjusttopH7.4