Transwell是檢測細胞侵襲能力的檢測方法

1、Transwell是檢測細胞侵襲能力的檢測方法我們所使用的是Chemicon公司的ECM554,基質(zhì)膠已經(jīng)包被好了,買來就可以用,很便利,而且我們算過,跟自己買膠來包被價格相差不大。這種膠4度下很軟,37度那么變得比擬堅硬,因此用前應先放在培育箱中10分鐘作用,使膠完全凝固。該試劑盒對穿過膜的細胞進行熒光染色,再用裂解液裂解細胞后檢測熒光值。我們在實際使用的時候對穿過膜的細胞接受1%結晶紫染色,鏡下計數(shù)細胞數(shù)目。結晶紫也可以用33%醋酸溶解,再用酶標儀570nm檢測,同樣可以反響穿過細胞數(shù)由于基質(zhì)膠的厚度直接影響穿過膜的細胞數(shù),因此建議有條件的話還是買這類已經(jīng)鋪好膠的試劑盒,比擬牢靠。說明書該

2、公司網(wǎng)上可以下載,對原理也有比擬簡略的闡述,可以去查一下。我們做的時候,上室用0.5%BSA的培育液,下室用5%血清的培育液,下室血清的濃度可依據(jù)細胞類型的不同進行調(diào)整,如果細胞侵襲能力強,可適當降低血清濃度,否那么可適當提高血清濃度。需要注意的是:1。上室內(nèi)的細胞數(shù)目要適當,過多,穿過膜的細胞會過多過快,如果用計數(shù)法的話將難以計數(shù);最少也要保證在收樣的時候,上室內(nèi)還要有細胞存在。簡略細胞密度需要自己摸索。2。細胞計數(shù)的精確性對結果影響很大,各組間最好不要分開計數(shù)。盡量用同一密度的細胞懸液給予不同處理,保證各組細胞量全都3。對細胞的處理不行影響細胞生存。否那么難以肯定是細胞量的轉變還是侵襲能力

3、轉變侵襲小室其實不止是transwell的,其它像Boyden chamber、Thincert也挺好用的。我用過Thincert,個人感覺不錯,而且價格廉價,是grelner的,孔徑8微米用于24孔板的一個才45塊人民幣,而且可以零買,不想transwell,總是一箱一箱的賣,實在是太貴了!侵襲實驗要結合實驗目的,不肯定非要包被的。下面奉上用Thincert做侵襲實驗的步驟(摘自?A quantitative cell migration assay using ThinCert cell culture inserts?,大家如需要,可用google搜之:1. Prepare cell c

4、ultures according to standard cell culture procedures2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA3. Harvest cells and wash them twice in PBS4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml5. Place 24 well ThinCertTM cell

5、culture inserts in the wells of a CELLSTAR® 24 well cell culture plate6. Add 600 µl culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate7. Add 200 µl cell suspension to each cell culture insert8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell cul

6、ture incubator at 37°C and 5 % CO29. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 µl serum-free culture medium with 8 µM Calcein-AM10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO211. Remove the culture medium

7、 from the cell culture inserts12. Transfer the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 µl prewarmed Trypsin-EDTA per well13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37°C and 5 % CO2, agitate the plate from time to time14. Discard th

8、e cell culture inserts and transfer 200 µl of the Trypsin-EDTA solution (now containing the migratory cells from each well into a black flat bottom 96 well plate15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm從第9步開頭計

9、數(shù)侵襲細胞時,這份說明書用的是熒光標記,但這種方法本錢高而且繁瑣。我做的時候改為giemsa染色,發(fā)現(xiàn)效果不錯,簡略如下:9.侵襲實驗完成后,取出小室,用棉簽當心將膜上外表的細胞擦拭去除;10.用手術刀片當心沿小室邊緣將膜切下;11.把膜下外表向上放在一個潔凈的24孔板的孔中;12.甲醇:冰醋酸(3:1固定10min后用10%giemsa染色;13.在顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)細胞(即染成紫紅色的點,未著色的多為細胞碎屑計數(shù)并拍照留念Transwell細胞體外侵襲實驗概述目的:總結并改良細胞體外侵襲實驗的操作閱歷。方法:接受改良后細胞體外侵襲實驗分別商量不同濃度TNF刺激下的HCCC2981

10、0 膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱;粉防己堿對HUVEC 人類臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移能力的抑制作用;VEGF 對人結腸癌HT229 細胞體外侵襲能力的影響。結果:改良后侵襲試驗定位精確,結果清晰。結論:依據(jù)作者建議的方法操作,能夠縮短實驗時間,有助于提高細胞體外侵襲實驗的質(zhì)量。細胞體外侵襲實驗主要應用于各種細胞因子對惡性腫瘤細胞侵襲和轉移的影響及一些抑制血管生成的新藥商量,但在簡略實驗中獲得真實、最正確實驗結果的圖像,并借以說明問題并非簡潔。很多商量人員在此方面花費了很多時間和科研經(jīng)費,從刺激實驗用的細胞到蘇木素染色,看似簡潔的實驗步驟中有很多環(huán)節(jié)需要商量者注意.材料與方法1. 1Matrigel:

11、Becton Dickinson Compary, - 20 保存;Tanswell plate:Costar ,USA , # 3422 ,聚碳酯膜微孔直徑為8m;蘇木素染液,梯度乙醇,二甲苯溶液。1. 2 趨化因子的制備取傳代其次天長勢良好的NIH3T3細胞,無血清培育基輕柔漂洗兩次; 參加無血清培育基,37,5 %CO2 培育24 h48h,收集細胞培育上清;4 ,12 000rpm 離心,10 min ,取上清;0.22 m 濾膜過濾除菌;分裝,在- 20 保存。1. 3transwell 培育板籌備全部操作均需無菌操作。-20保存的Matrigel 在冰上保28過夜融化。在冰上用預冷

12、的槍頭吸取100l Matrigel 參加冰預冷的300l 無血清培育基中,充分混均。取上述稀釋的Matrigel 25 l 參加transwell 板上室,掩蓋整個聚碳酯膜,37 ,30 min ,使Matrigel 聚合成膠。已鋪好Matrigel的transwell 培育板置于37可保存2 周。1. 4Matrigel 侵襲實驗(Matrigel Invasion Assay刺激后的各組細胞用PBS 漂洗3 次。以常規(guī)方法用無血清培育基制備單細胞懸液,5 ×105個細胞/ ml ,每組細胞各分為兩局部。胎盤蘭拒染實驗,細胞活力需大于95 %。Transwell 培育板上室參加1

13、00l 細胞懸液( 5 ×104 個 并參加無血清培育基200 ul 。Transwell 培育板下室參加500l 趨化因子,37,5 %CO2 培育24 h。用濕棉簽輕輕擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上外表的細胞。當心取出上室,用線拴住,并做好標記,用冰預冷的甲醇固定30 min。蘇木素染色1 min。梯度乙醇脫水(80 % ,95 % ,100 % ,二甲苯透明。當心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片。附著于聚碳酯膜下外表的細胞在高倍鏡下( ×400 隨機取6 個視野1 計數(shù),取平均數(shù)。重復實驗兩次?？记绊氈?. 1NIH3T3 細胞制備的趨化因

14、子與胎牛血清趨化因子是能使細胞產(chǎn)生趨化運動的一類細胞因子2 。目前利用NIH3T3 細胞制備趨化因子做細胞體外侵襲實驗的實驗室比擬多,時間較長且實驗步驟繁瑣。眾所周知,胎牛血清中有趨化因子,我們在不同濃度TNF刺激下的HCCC29810 膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗中發(fā)現(xiàn)用胎牛血清和用NIH3T3 細胞制備的趨化因子做細胞體外侵襲實驗效果是一樣的,兩組遷移的細胞數(shù)很接近。在實驗時間上,用NIH3 T3細胞制備趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為1 周,而用胎牛血清作趨化因子做細胞體外侵襲實驗周期為2 d ,實驗時間節(jié)省了很多。因此認為可以用胎牛血清來代替NIH3T3 細胞制備的趨化因子。2.

15、2 細胞的籌備所需細胞應處在對數(shù)生長期,細胞活力需大于95 %。如果細胞活力小,就會造成細胞穿透能力下降,影響實驗結果。2. 3 擦去Matrigel 凝膠和聚碳酯膜上外表的細胞先用干棉簽將上室內(nèi)液體吸去,再用蒸餾水浸濕的棉簽輕輕擦去Mat rigel 凝膠和聚碳酯膜上外表的細胞,如果沒有擦凈聚碳酯膜上外表的細胞,在細胞計數(shù)時就會將沒擦掉的細胞也計進來。尤其是細胞為圓形的時候,就會分辨不出是穿過去的細胞還是沒穿過去的細胞,對于長梭形細胞來說,穿過去的細胞為長梭形,沒穿過去的細胞多為圓形。2. 4 蘇木素染色上室浸泡在新蘇木素中的時間為1 min ,用過屢次的蘇木素為2 min。在商量粉防己堿對

16、HUVEC 人類臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移能力的抑制作用沒有將多余蘇木素洗去,直接脫水、透明,造成細胞圖片背景模糊,細胞不清晰。在作不同濃度TNF刺激下的HCCC29810 膽囊癌細胞體外侵襲能力的強弱實驗時我們將其置于盛有自來水的燒杯中,反復漂洗幾次,將多余蘇木素洗去再行脫水、透明;這樣做出的細胞圖片背景潔凈,細胞清晰。2. 5 脫水和透明時間脫水時間各為1 min ,在二甲苯中的時間不要過長,以2 min3 min 為宜;尤其是同時操作多個樣本時,時間過長就會造成局部聚碳酯膜從上室基底部自動脫落下來,上室間粘連在一起,造成樣本混淆,實驗失敗。建議在最后一步實驗時需二人協(xié)做,一人區(qū)分并取出樣本,一人當心將聚碳酯膜自上室基底切取下來,置載玻片上中性樹脂封片并及時編號。2. 6 細胞計數(shù)當實驗用的細胞為圓形時,實驗人員容易將聚碳酯膜上小孔誤認為細胞進行計數(shù)。我們在作VE