第七章 核酶工程

1、1第七章 核酶工程2近年來，酶學(xué)與其他學(xué)科交叉和滲透十分活躍，其研究領(lǐng)域得到了進(jìn)一步擴展。 1873年發(fā)現(xiàn)第一個酶開始，經(jīng)歷了很長時間，在1936年得到結(jié)晶酶，才認(rèn)識到酶是蛋白質(zhì)。 19831986年已經(jīng)認(rèn)識到有些酶是由核酸組成，酶催化的本質(zhì)是RNA。例如核糖核酸酶，磷酸果糖激酶等3原生動物四膜蟲rRNA作用 加工成成熟的26S rRNA.82年研究發(fā)現(xiàn): (1) 四膜蟲rRNA前體有6400個核苷酸，其中有兩個外顯子和一個內(nèi)含子, 成熟過程是內(nèi)含子切除，兩個外顯子連接成成熟的rRNA，這個過程稱為剪接。 這個剪接過程不需要別的酶參與催化，不需要ATP等提供能源，靠5-GMP、Mg2+參與。這

2、種 rRNA 前體自我剪接功能的特性，排除了任何蛋白質(zhì)的催化作用。4但當(dāng)時有爭議：1）它只是自身催化，而不能催化其他分子反應(yīng)。2）一般意義上的酶催化劑在反應(yīng)前后應(yīng)該沒有變化。而在rRNA前體成為成熟的rRNA，切去內(nèi)含子后，它不再有催化能力。如(1) 四膜蟲前體rRNA在低濃度陽離子下，切去一個內(nèi)含子，內(nèi)含子，余下部分連成成熟的rRNA，這種自我剪接是靠自己的前體rRNA。5 rRNA自我剪接的前體加工功能與自身的結(jié)構(gòu)有關(guān)。 而且還發(fā)現(xiàn)高溫、內(nèi)含子互補的核苷酸序列、高濃度的變性劑等可以使之喪失自我剪接的加工功能。 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這種自我的剪接以后釋放出來的內(nèi)含子內(nèi)含子可以通過轉(zhuǎn)磷酸酯反應(yīng)自

3、我環(huán)化。65-G-IVS-G-3(414nt) 去5-GA-(15nt)- + 成環(huán) (399nt) 去5-4nt + 開環(huán) (395nt) 開環(huán)后無法再環(huán)化 線狀395nt (稱為L-19IVS)L-19IVS分子分子缺少內(nèi)催化功能。但可以催化其他缺少內(nèi)催化功能。但可以催化其他RNA分子分子a. 轉(zhuǎn)核苷酸作用 b. 水解作用 c. 轉(zhuǎn)磷酸作用 d. 去磷酸作用 e. RNA限制性內(nèi)切酶作用 e作用時用天然和人工合成的RNA底物都有相同的結(jié)果。 RNA內(nèi)切酶與DNA內(nèi)切酶作用一樣，底物不同。7實驗：發(fā)現(xiàn)RNA催化劑的活性部位含多聚 GMP，其作用是催化劑和底物形成非共價鍵而發(fā)揮作用。 其催化中

4、心是5GCAGGG3，L-19IVS中中395個個核苷酸 3-過碘消去G 加入G 失去催化活性 活性又有了 如用點突變法作成5-GCAGGG-,-GGCGGG-等一系列人工催化劑，可以限制性的水解相應(yīng)的底物，表明不同催化劑的活性部位催表明不同催化劑的活性部位催化所對應(yīng)的底物?；鶎?yīng)的底物。8 天然與人工天然與人工RNA催化劑的底物專一性催化劑的底物專一性RNA催化劑（線狀394ntRNA的2227） 底物 產(chǎn)物5 3 I（5 3） II GGCCU CUA5（1） GGCCUCUGA5 GGCCU GUA5（2） G - -GGAGGG- GGCC GCUA5 （3） - (1) - -G

5、CAGGG- (2) G GGCCUGU GA5 (3) - (1) - -GG CGGG- (2) G - (3) GGCCGCU GA5 9 通過這些研究，已經(jīng)知道RNA催化劑的活性部位及其底物專一性。 RNA催化劑的這個特性，由人工制造出一系列新的催化劑，不斷擴大其應(yīng)用領(lǐng)域。 這些人工催化劑對競爭性抑制劑十分敏感。所以，這些催化劑具有蛋白質(zhì)催化劑的一些特征。也可以滿足生物催化劑所必需的結(jié)構(gòu)要求。 10二個例子：二個例子：RNase P(核糖核酸酶核糖核酸酶 ) 蛋白質(zhì)部分 RNA部分作用 催化tRNA前體的5-端成為成熟的內(nèi)切核酸酶組成 1/4為protein， 3/4為RNA,RNas

6、e P-RNA 叫RNase P-蛋白質(zhì)對酶作用 不抗 RNase A對其有 水解作用, 抗胰蛋白酶作用對RNase 分離后，RNase ，蛋白質(zhì)部分都沒有活性，P分離 重新合并又有活性分別處理 沒有活性 P-RNA，在20mM Mg+ 條件下，有RNase P作用。 RNA部分用SDS-酚抽提或者 蛋白酶作用，都不受影響。體外轉(zhuǎn)錄從E.coli的基因在體外轉(zhuǎn)錄，得到的產(chǎn)物RNase P前體，同樣能加工tRNA前體，RNase P-RNA 前體和RNase P-蛋白質(zhì)可以重組成全酶。11特定構(gòu)象問題特定構(gòu)象問題 P-RNA稱為M1 RNA，由377個核苷酸組成，RNase P叫C5蛋白，它可以

7、通過層析方法分開，也可以重新組成有活性全酶。另一蛋白質(zhì)部分卻沒有活性，但可維持酶的特定構(gòu)象。 M1 RNA在3-去122個核苷酸，仍然有活性，5去70個核苷酸，卻沒有活性。專一性問題專一性問題 蛋白質(zhì)部分（C5蛋白），是維持酶活性構(gòu)象所必需的，可促進(jìn)酶反應(yīng)速度。如加入適當(dāng)?shù)膬蓚€部分，可以提高酶活性24倍。C5蛋白具有底物專一性，且用精胺和亞精胺不能替代。12ribozyme的種類：的種類：1）分催化分子內(nèi)反應(yīng) 自我剪切（self-cleavage)2）分子間反應(yīng) 自我剪接(ribozyme)自我剪接自我剪接ribozyme 四膜蟲前體rRNA切出的一個內(nèi)含子，內(nèi)含子，就是這個類型。有兩種作用：

8、1）一個是分子內(nèi)部的作用2）另一個是作用于分子之間尤其是分子之間的作用，這兩個作用最引人注目。13一個類型 自我剪接要GMP和和Mg2+,而且在離體條件下，還可以催化分子間的反應(yīng)，一個是CpU+GpN-CpUpN+G，另一個是-U+GpN-UpN-+G另一類型 自我催化不要不要GMP, 但是要但是要Mg2+，而在細(xì)胞核mRNA前體的剪接需要核小分子核糖核蛋白參與反應(yīng)。 自我剪切（自我剪切（self-cleavage)特點特點：如T4RNA前體在沒有酶參與下能進(jìn)行自我剪切，而加入非離子去污劑后可以促進(jìn)反應(yīng)。 這種自我剪切反應(yīng)在病毒、類病毒當(dāng)中可以見到。14催化分子間反應(yīng)的自我剪切催化分子間反應(yīng)的

9、自我剪切如L-19IVS那樣具有5種催化活性。a. 轉(zhuǎn)核苷酸作用 b. 水解作用 c. 轉(zhuǎn)磷酸作用, d. 去磷酸作用 e. RNA限制性內(nèi)切酶作用 另外，通過定點突變?nèi)斯ぶ圃斐瞿壳斑€沒有的RNA限制性內(nèi)切酶。 M1 RNA在一定條件下有RNase P全酶的活性。已發(fā)現(xiàn)不同細(xì)菌中的RNase P- RNA的核苷酸順序有不同，可以與RNase P-蛋白質(zhì)交叉重組，得到不同的組合RNase P。15 真核生物的RNase P- RNA具有原核生物RNase P- RNA相似的活性和一些理化性質(zhì)，但分子量相對較小。 尤其通過對真核生物的RNase P結(jié)構(gòu)與功能的研究，已經(jīng)知道一類結(jié)構(gòu)相似的小分子可成

10、為我們所需要的催化劑。 通過對原核生物RNase P結(jié)構(gòu)與功能的研究，成功構(gòu)建了比較小的成熟ribozyme，比原來還小大約150bt的ribozyme。16 又如兔肌1,4-葡萄糖分支酶是一個RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。RNA部分只有31個核苷酸，而且發(fā)現(xiàn)其中有8種經(jīng)過修飾的核苷酸10個。第一次知道這種酶底物不是RNA的 ribozyme。 1990年發(fā)現(xiàn)底物是DNA的ribozyme 1992年發(fā)現(xiàn)底物是氨基酸酯的ribozyme，而且知道它具有多種催化功能(氨酰tRNA合成、肽基轉(zhuǎn)移酶）等。17第一節(jié)第一節(jié) 天然核酶天然核酶v到目前為止，在自然界中發(fā)現(xiàn)的核酶根據(jù)其催化的反應(yīng)可以分成兩大類：剪切

11、型核酶，這類酶催化自身或異體RNA的切割，主要包括錘型核酶、發(fā)夾型核酶、丁型肝炎病毒核酶以及蛋白質(zhì)RNA復(fù)合酶（RNaseP）剪接型核酶，主要包括組I內(nèi)含子和組II內(nèi)含子，實現(xiàn)mRNA前體自我拼接，具有核酸內(nèi)切酶和連接酶兩種活性。18錘頭型核酶v錘頭結(jié)構(gòu)（hammerhead structure）狀二級結(jié)構(gòu)，由13個（后來證明只需11個）保守核苷酸殘基和3個螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成（圖71）v只要具備錘頭狀二級結(jié)構(gòu)和13個保守核苷酸，剪切反應(yīng)就會在錘頭結(jié)構(gòu)的右上方GUX序列的3端發(fā)生v無論是天然的還是人工合成的錘頭結(jié)構(gòu)都由兩部分構(gòu)成：催化結(jié)構(gòu)域（R）和底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（S）1920v錘頭型核酶催化反應(yīng)可能的

12、機制： “單金屬氫氧化物離子模型” （圖72(a) ）,金屬氫氧化物作為廣義堿從2-羥基獲得一個質(zhì)子，這個被活化了的2-羥基作為親核基團(tuán)攻擊切割位點的磷酸 “雙金屬離子模型”（圖72(b)），金屬離子作為Lewis酸接收2和 5-羥基的電子，極化并減弱OH鍵或OP鍵HDV（丁型肝炎病毒）中的核酶顯示了不同的催化機制（圖72(C)），胞嘧啶充當(dāng)一般堿，咪唑環(huán)上的N吸引2-羥基上的質(zhì)子，活化羥基上的O，這個O親核攻擊相鄰核酸骨架上的P并使磷酸酯鍵斷裂212223發(fā)夾型核酶v發(fā)夾狀二級結(jié)構(gòu)，由50個堿基的核酶和14個堿基的底物形成，包括4個螺旋和5個突環(huán)（圖73）24蛋白質(zhì)RNA復(fù)合酶v由蛋白質(zhì)和R

13、NA兩個組分構(gòu)成v如大腸桿菌tRNA5成熟酶，主要催化tRNA前體成熟過程，M1RNA組分單獨具有全酶活性，蛋白質(zhì)只維護(hù)M1RNA的構(gòu)象v錘頭型和發(fā)夾型核酶及HDV RNA、鏈孢霉線粒體RNA等切割底物RNA后的產(chǎn)物都是3端的2-3環(huán)磷鍵及新5端羥基；蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合酶催化得到的產(chǎn)物的3端是羥基，5端是磷酸25端粒酶 實際上是一個核糖核蛋白復(fù)合體由RNA成分 結(jié)合蛋白質(zhì)亞單位共同組成用Rnase破壞RNA成分用蛋白酶K破壞蛋白質(zhì)成分端粒酶完全無活性 端粒酶完全失去活性26端粒酶在表達(dá)上： RNA成分和結(jié)合蛋白質(zhì)成分兩者缺一不可。在表達(dá)的調(diào)控上： RNA成分和結(jié)合蛋白質(zhì)成分兩者是分離的。 結(jié)合

14、蛋白質(zhì)成分總是與酶活性同時出現(xiàn)或者都不存在。27 在人體細(xì)胞抽提液中，端粒酶全酶與hTERT（human telomerase reverse transcriptase) 有共沉淀現(xiàn)象。 表明hTERT與端粒酶活性間的密切關(guān)系。 體外試驗中將人端粒酶模板成分hTR（ human telomerase RNA component) 與hTERT混合可重構(gòu)端粒酶活性。 28端粒酶與衰老有關(guān) 在端粒酶陰性的二倍體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入編碼hTERT的基因，也可激活端粒酶，結(jié)果DNA分子端粒長度增加，細(xì)胞壽命延長，老化過程減緩，但其核型及表型均保持正常，沒有惡性轉(zhuǎn)變的跡象。 在臨床腫瘤組織樣本中也發(fā)現(xiàn)，hTR通

15、常在正常組織及腫瘤組織中均能檢測到，但hTERT只特異性表達(dá)于腫瘤組織。29 所有這一切說明，蛋白催化亞單位是端粒酶活性的限制因素。 端粒酶激活可能是一個多步驟過程，至少包括以下兩個層次:其一是端粒酶RNA成分的上調(diào)；其二是蛋白組分特別是催化亞單位的表達(dá)。 所以，現(xiàn)在已經(jīng)知道端粒酶與細(xì)胞衰老和腫瘤有關(guān)系。 細(xì)胞分裂一次，認(rèn)為在端區(qū)丟失(50200bp/代)可以控制細(xì)胞分裂，被看成是一個分裂鐘。30 同時，端粒酶的活性與腫瘤的診斷和預(yù)后的評估直接有關(guān)。有關(guān)端粒酶研究的報道很多，到1998年，己超過3000篇。 根據(jù)資料分析，85%以上的腫瘤樣本表達(dá)端粒酶活性只有少數(shù)幾種腫瘤端粒酶陽性率相對較低（

16、如在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤陽性率為55%75%,成視網(wǎng)膜細(xì)肥瘤為50%，腦脊膜瘤和星形細(xì)胞瘤中更低一些）。但是已經(jīng)看出端粒酶活性是迄今所知的人體腫瘤的特異性最強的生物標(biāo)志，因而對臨床腫瘤病人的診斷與治療有重要意義。 31 端粒酶活性分析作為腫瘤診斷指標(biāo)的另外一個優(yōu)點是在某些腫瘤類型，惡變前端粒酶已被激活，隨著腫瘤進(jìn)展，端粒酶活性逐漸上升 端粒酶活性監(jiān)測可作為早期診斷或預(yù)警的一個指標(biāo)。如在宮頸部位，從宮頸上皮內(nèi)增生到出現(xiàn)明顯癥狀的腫瘤這一過程，是與端粒酶活性的上升密切相關(guān)的。在前列腺腫瘤形成過程中也有類似情況，從出現(xiàn)良性增生到前列腺癌變的整個進(jìn)展過程，端粒酶活性一直上升 端粒酶活性也是腫瘤患者預(yù)后評估的良

17、好指標(biāo)，如胃癌患者，端粒酶往往與腫瘤尺寸，轉(zhuǎn)移情況和患者存活時間相關(guān)32 另外，在白血病、腦脊瘤和乳腺癌患者，端粒酶往往與腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況、存活時間相關(guān)。端粒酶活性高預(yù)后不良，端粒酶活性越高，預(yù)后越差。 端粒酶還作為腫瘤治療的作用靶位，從最先發(fā)現(xiàn)瑞粒酶可延仰端粒長度起，就認(rèn)為端粒酶抑制劑可阻止細(xì)胞的惡性分裂增殖，因而有可能用于抗腫瘤。 近來對以端粒酶為作用靶點的抗腫瘤研究非活躍。33代表性的研究方向有 1.阻斷端粒酶RNA的模板作用來抑制端粒酶活性（比如通過反義核酸技術(shù)或構(gòu)建錘頭狀核酶破壞端粒酶RNA的模板功能 ）2.逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 3.核苷酸類似物4.蛋白激酶C抑制劑 5.細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑前

18、4種途徑因作用太廣泛，特異性不高，毒副作用明顯，進(jìn)展不大。 其中細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑抑制端粒酶活性的研究是進(jìn)展最明顯的。為了確定永生化細(xì)胞的表型分化是否與端粒酶活性調(diào)控有關(guān)。34組I內(nèi)含子和組II內(nèi)含子v組I內(nèi)含子（group I intron）和組II內(nèi)含子（ group II intron ）這類核酸比較復(fù)雜，通常包括200個以上的核苷酸，主要催化mRNA前體的拼接反應(yīng)。v組I內(nèi)含子核酶催化反應(yīng)可以在體外無蛋白質(zhì)參與下除掉自身內(nèi)含子，包括兩個連續(xù)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，并且需要Mg2+或Mn2+及鳥苷（或鳥苷酸）的參與v組I內(nèi)含子還可催化各種分子間反應(yīng)，包括剪切RNA和DNA、RNA聚合、模板RNA連接等v

19、組I內(nèi)含子和組II內(nèi)含子的主要差別是第一步反應(yīng)的化學(xué)機制，在I中，外部的鳥苷的3-羥基作為進(jìn)攻基團(tuán)，而在II中，是內(nèi)部腺苷的2-羥基起作用35v組I內(nèi)含子和組II內(nèi)含子的剪切機制如圖74所示36第二節(jié) 功能性核酸的體外選擇v體外選擇（invitro selection）或指數(shù)擴增法系統(tǒng)進(jìn)化配體（systematic evolution of ligands by exponential amplification, SELEX）是從順序隨機的RNA或DNA分子構(gòu)成的大容量隨機分子庫出發(fā)，在其中篩選得到極少數(shù)具有特定功能的分子。v這些技術(shù)拓寬了對核酸分子催化能力的認(rèn)識，同時提供了新型的醫(yī)療診斷試

20、劑。37功能性核酸篩選的基本思想v在一個順序隨機的RNA分子庫中，通過一定的篩選方法，得到極微量的具有某種功能（切割或連接核酸分子、與配體結(jié)合等）的RNA分子，然后用RTPCR將這些微量到難以檢測的分子擴增，再對PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析以及其他各種性質(zhì)的測定。v利用待篩選分子的可遺傳特性，將分子的基因型和表現(xiàn)型聯(lián)系起來，在篩選得到具有目的性質(zhì)的表現(xiàn)型的同時也獲得了可以體現(xiàn)這種性質(zhì)的基因型。38對RNA和靶分子的結(jié)合能力的篩選v最早體現(xiàn)這種篩選思想的是20世紀(jì)60年代利用RNA噬菌體Q進(jìn)行的實驗，該病毒的基因組可以在體外被Q復(fù)制酶擴增。該實驗的另一個先進(jìn)思想是通過在體外反應(yīng)體系中加入EB或改變四種

21、dNTP的濃度來增加基因組復(fù)制過程中的突變率。v用化學(xué)法合成的DNA分子可以在其鏈的任何位置上引入完全隨機的順序；反轉(zhuǎn)錄酶和PCR技術(shù)的應(yīng)用使人們可以在體外條件下不必依靠Q復(fù)制系統(tǒng)就能很容易的擴增出幾乎任何的核酸系列。v所有這些開發(fā)出多種RNA分子的體外選擇和定向進(jìn)化方法，為獲得新功能的RNA創(chuàng)造了條件。39RNA適體v在體外選擇中得到的可以與目標(biāo)分子結(jié)合的RNA分子稱為目標(biāo)分子的RNA適體（aptamer）。v適體是能與有機物或蛋白質(zhì)等配體專一、高效結(jié)合的RNA或DNA片段，分別稱為RNA適體或DNA適體 。篩選一種適體的一般方案如圖75所示。v功能性核酸通常含有若干構(gòu)成保守的二級結(jié)構(gòu)的長度

22、比較小的功能中心序列，這些序列由長短不一、順序不同的突環(huán)（loop）連接。這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)不論在長短還是堿基配對方面均可承受一定的變化，而不顯著影響功能性核酸的活性，這就是功能性核酸順序的冗余性。4041適體的選擇v適體雖然不是酶，但是篩選原理也與核酶的基本一樣。另外適體可以作為核酶的底物結(jié)合模塊或者輔助因子結(jié)合模塊被引入到核酶中，同時適體本身也具有很大的應(yīng)用價值。v有些結(jié)構(gòu)更為簡單的適體同樣具有與相應(yīng)配基的高度親和力，如黃素單核苷酸與托普霉素的RNA適體（圖76）v通過體外選擇的方法還得到了一些蛋白質(zhì)以及RNA分子的RNA適體， RNA適體可以通過與這些大分子相互作用來調(diào)節(jié)它們的生理功能，圖77

23、是HIV的Rev蛋白及其適體的作用模型424344核酶的體外選擇v用與體外選擇適體類似的方法也可以獲得具有催化功能的核酸核酶v用來改變已知核酶的催化功能、創(chuàng)造具有新的催化活性的核酶、解析核酶的空間結(jié)構(gòu)以及研究核酶的催化機制和折疊途徑。v一般有催化活性的RNA明顯比適體類RNA結(jié)構(gòu)復(fù)雜得多，很難從一個隨機庫里直接篩選得到，需要在每輪篩選之間用易錯PCR的方法引入突變，增加其多樣性以獲得最優(yōu)的催化分子。45催化與磷酸基團(tuán)相關(guān)的反應(yīng)v主要是由于技術(shù)上的原因，大多數(shù)核酶的篩選都是圍繞磷酸酯轉(zhuǎn)移反應(yīng)。v目前體外選擇得到的催化與磷酸基團(tuán)相關(guān)的反應(yīng)的核酶主要具有以下催化活性：識別一定的DNA/RNA順序并在

24、特定位點進(jìn)行切割、連接RNA分子的活性、磷酸激酶活力和磷酸酶活力等。v圖78是第一次從一個完全隨機庫中篩選核酶的基本過程v已用體外選擇策略獲得了許多催化磷酸酯轉(zhuǎn)移和水解反應(yīng)的核酶（圖79）4647催化與磷酸基團(tuán)不相關(guān)的反應(yīng)v天然存在的核酶都是催化與磷酸基團(tuán)相關(guān)的化學(xué)反應(yīng)，這類反應(yīng)都需要二價金屬離子的參與。但體外選擇的結(jié)果證明核酸也可以加速其他一些反應(yīng)類型。可以自身烷基化的RNA可以催化自身氨?；暮嗣复呋０锋I形成的核酶也已篩選得到48v圖7-10和7-11列舉了一些可以被核酶催化完成的反應(yīng)4950第三節(jié) 脫氧核酶v缺少RNA中2羥基的DNA可形成特定的高級結(jié)構(gòu)，在輔助因子的協(xié)助下，催化完成某

25、些化學(xué)反應(yīng)。v人們利用體外選擇技術(shù)獲得了許多具有催化功能和其他一些功能（DNA適體等）的DNA分子。v1994年，Breaker等首次發(fā)現(xiàn)了切割RNA的DNA分子，并將其命名為脫氧核酶（deoxyribozyme或DNAzyme）。v脫氧核酶體外選擇方法與核酶體外選擇相似，所不同的是不需要轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄。51v篩選過程中，對每輪所獲得的微量具有催化功能的DNA進(jìn)行PCR擴增時，一般采用正鏈引物上連接生物素，PCR產(chǎn)物通過抗生素蛋白親和柱達(dá)到正鏈與負(fù)鏈的分離，獲得單鏈DNA，以進(jìn)入下一輪篩選。v脫氧核酶的特點：結(jié)構(gòu)穩(wěn)定成本低廉易于合成和修飾52v與核酶和許多蛋白酶類似，大多脫氧核酶的催化也需要輔助

26、因子或輔酶幫助實現(xiàn)功能。vMg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+、Ca2+等二價金屬離子輔助因子。三價金屬離子也可以作為輔助因子。v把額外的功能團(tuán)移入RNA和DNA中以增加結(jié)構(gòu)和功能多樣性，包括在RNA和DNA上增加基團(tuán)，用氨基酸或其他有機物作為真正的輔因子。采用輔酶、維生素、氨基酸等有機小分子作為輔助因子，借助有機小分子具有更為多樣性的活性基團(tuán)和空間結(jié)構(gòu)，來增加DNA/RNA的催化潛能。53v目前已通過體外選擇方法獲得的脫氧核酶的功能主要有以下幾類：切割RNA的脫氧核酶。因為切割RNA分子而可以應(yīng)用于基因治療中，阻斷體內(nèi)有害RNA的表達(dá)切割DNA的脫氧核酶。采用氧化機制自身分裂的DNA酶和采

27、取直接水解機制分裂DNA連接酶功能的脫氧核酶具有激酶活力的脫氧核酶。如多核苷酸激酶和過氧化物酶功能催化卟啉環(huán)金屬螯合反應(yīng)54v圖712顯示了切割RNA的1023脫氧核酶的二級結(jié)構(gòu)：v圖713顯示了具有連接酶活力的脫氧核酶的催化機理55第四節(jié) 核酶/脫氧核酶的催化潛能和進(jìn)化策略v目前獲得的核酶/脫氧核酶與蛋白質(zhì)酶在催化反應(yīng)類型和活力上都相關(guān)甚遠(yuǎn)，主要原因是：從本身的化學(xué)組成來看，蛋白質(zhì)比核酸具有更大的催化潛能，表現(xiàn)在蛋白質(zhì)中有許多RNA/DNA中所沒有的共價催化基團(tuán)以及酸堿催化基團(tuán)，還有非極性的活性中心空穴及三級結(jié)構(gòu)，組合多樣性也多出許多數(shù)量級蛋白質(zhì)分子存在于整個自然界中，經(jīng)過長期進(jìn)化，已獲得了

28、十分復(fù)雜的結(jié)構(gòu)56v核酶/脫氧核酶與蛋白質(zhì)酶的催化活力比較：57v為獲得催化種類更加多樣、性質(zhì)更加優(yōu)良的（脫氧）核酶，可采用以下幾種策略來克服由于核酸本身以及篩選條件造成的障礙：v引入其他催化基團(tuán)將額外的功能團(tuán)移入RNA/DNA中以增加結(jié)構(gòu)和功能多樣性，如氨基酸或其他有機物直接將一些活性基團(tuán)引入到RNA/DNA分子上v擴大篩選庫的容量v模擬自然進(jìn)化的合理性設(shè)計，通過模擬自然進(jìn)化來突破庫容量的限制58第五節(jié) 核酶/脫氧核酶的應(yīng)用v核酶/脫氧核酶最主要的應(yīng)用是基因治療v基因治療的主要策略包括：向體內(nèi)導(dǎo)入外源基因，取代體內(nèi)有缺陷的基因發(fā)揮作用對致病基因進(jìn)行抑制，利用反義核酸或核酶通過干涉致病基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯清除其表達(dá)產(chǎn)物具有切割和連接活性的組I內(nèi)含子可以對發(fā)生