細菌生化試驗

1、實驗十三細菌鑒定中常用的生理生化試驗一、實驗目的1、了解不同微生物對不同的生物大分子的分解利用情況，認識微生物代謝類型的多樣性；2、掌握進行微生物大分子水解試驗的原理和方法。二、基本原理各種微生物在代謝類型上表現(xiàn)有很大的差異，表現(xiàn)在對生物大分子糖類和蛋白質(zhì)分解能力，以及最終代謝產(chǎn)物的不同，反映出它們具有不同的酶系。微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物，因此，微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物生化反應的多樣性一是使自然界的有機分子都有可能得到分解，二是使不同微生物之間有了相互作用和依賴的基礎。微生物對大分子

2、的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)降解，胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大的物質(zhì)為小的化合物，使其能被運輸至細胞內(nèi)。三、實驗器材1、菌種枯草芽抱桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌，普通變形桿菌O辰關宜2、A口仆是固體油脂培養(yǎng)基、固體淀粉培養(yǎng)基，葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基3、溶液或試劑革蘭氏染色用碘液，酚紅，澳甲酚紫4、儀器及其他用具無菌平板、無菌試管、接種環(huán)、接種針、試管架四、實驗方法及步驟（一）淀粉水解實驗試驗方法：以18-24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區(qū)劃+“字接種，）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1C培養(yǎng)24-48h,

3、或于20c培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環(huán)或肉湯呈深藍色。淀粉水解系逐步進行的過程，因而試驗結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。（二）明膠水解試驗有些細菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多肽，又進一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。方法：挑取18-24h待試菌培養(yǎng)物，

4、以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養(yǎng)基。于20-22C培養(yǎng)7-14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1C<每天觀察結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時應不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細菌液化，如確被液化，即為試驗陽性。平板試驗結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點種的菌落上滴加試劑，若為陽性，10-20min后，菌落周圍應出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。（三）糖類發(fā)酵試驗可根據(jù)細菌分解利用糖能力的差異表現(xiàn)出是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣作為鑒定菌種的依據(jù)。是否產(chǎn)酸，可在糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入指示劑澳甲酚紫（即B.C.P指示劑，其pH在5.2以下呈黃色，pH在6.8以上呈紫色），經(jīng)培養(yǎng)后根

5、據(jù)指示劑的顏色變化來判斷。是否產(chǎn)氣，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中放入倒置杜氏小管觀察。流程：發(fā)酵液試管-標記-接種-培養(yǎng)-觀察-記錄1.操作前注意觀察未接種細菌的正常單糖發(fā)酵管狀況。2、接種培養(yǎng)以無菌操作分別將少量菌苔接種于乳糖發(fā)酵管及葡萄糖發(fā)酵管中；，每種糖發(fā)酵管的空白對照均不接菌。置37。叵溫箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24h、48h、和72h觀察結(jié)果。3、觀察記錄與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“+”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“+

6、”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應，記錄用“”表示。（四）乙酰甲基甲醇試驗（V.P試驗）某些細菌在葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)液中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫竣成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中氧，氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白陳中的“瓜基生成紅色化合物，稱V-P（+）反應。流程：培養(yǎng)液試管-標記-接種-培養(yǎng)-觀察-記錄1、標記試管取5支裝有葡萄糖蛋白陳培養(yǎng)液的試管，分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽抱桿菌和空白對照。2、接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應試管中，空白對照管不接菌，置37C恒溫箱中，培養(yǎng)2448h。3、觀察記錄取出以上試管，充分振蕩2min。每管

7、分別加入40%NaOH溶液1020滴，并加等量a-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37。叵溫箱中保溫1530min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V.P.試驗陽性反應（用“十”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗陰性反應（用“一”表示）。注意：原試管中留下的培養(yǎng)液用作甲基紅試驗。（五）甲基紅試驗（M.R.試驗）腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。.流程培養(yǎng)液指小劑觀察記錄結(jié)果于V.P.試驗留下的培養(yǎng)液中，各加入23滴甲基紅指示劑，

8、注意沿管壁加入，仔細觀察培養(yǎng)液上層，若培養(yǎng)液上層變成紅色，即為陽性反應；若仍呈黃色，則為陰性反應，分別用“十”或“一”表示。（六）呷咪試驗有些細菌含有色氨酸酶，能分解蛋白陳中的色氨酸生成呷咪（靛基質(zhì)）。呷咪本身沒有顏色，不能直接看見，但當加入對二甲基氨基苯甲醛試劑時，該試劑與呷咪作用，形成紅色的玫瑰呷珠。流程：標記試管-接種-培養(yǎng)-觀察-記錄1、試管標記取裝有蛋白陳水培養(yǎng)液的試管5支，分別標記大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、普通變形菌、枯草芽抱桿菌和空白對照。2、接種培養(yǎng)以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應試管中，第5管作空白對照不接種，置37。叵溫箱中培養(yǎng)2448h。3、觀察記錄在培養(yǎng)液中加入乙醴12ml,經(jīng)充分振蕩使呷珠萃取至乙醴中，靜置片刻后乙醴層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入510滴呷咪試劑（加入呷咪試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醴層影響結(jié)果觀察），如有呷珠存在，乙醴層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為呷珠試驗陽性反應，否則為陰性反應，陽性用“十”陰性用“一表小0五、注意事項1 .要嚴格按照培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，防止雜菌污染。2 .觀察結(jié)果時要注意滴加藥量及反應時間。六、實驗報告1、記錄生理生化反應測定結(jié)果.2、你怎樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？3