蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)-文檔

1、蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織基因組DNA勺提取及質(zhì)量檢測(cè)收稿日期：2021-06-25基金工程：公益性行業(yè)農(nóng)業(yè)科技專項(xiàng)編號(hào)：202103034、202103004;國(guó)家蘋果現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系工程編號(hào)：CARS-28.通信王亞南,女,博士,副教授,主要從事分子植物病理學(xué)研究.Tel:03127528157;E-mail:wyn321534716&蘋果屬于薔薇科Rosacea仁果亞科Pomoidea蘋果屬M(fèi)alusMill.植物,在我國(guó)有悠久的栽培歷史.最新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2021年,我國(guó)蘋果栽培面積到達(dá)206萬(wàn)hm2,產(chǎn)量3700萬(wàn)t,我國(guó)已經(jīng)成為世界上最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)1.我國(guó)蘋果上的枝干病害

2、如蘋果樹腐爛病、輪紋病等嚴(yán)重影響蘋果樹的生長(zhǎng)及產(chǎn)量,從分子水平研究枝干病害對(duì)病害的正確診斷、病菌的分布以及有效防治策略的制定有十分重要的意義.植物DNA勺提取方法在很多文獻(xiàn)中都有大量報(bào)道2-5,而蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部中含有大量的酚類、多糖等次生代謝物質(zhì),嚴(yán)重影響基因組DN碾取的得率和純度.本試驗(yàn)對(duì)改進(jìn)的CTA砒、快速鹽提法、試劑盒法這3種提取總DNA勺方法進(jìn)行比擬分析,試圖確立適于蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部基因組DNAI取的最正確方法,以便于進(jìn)行枝干病害的分子生物學(xué)研究.1材料與方法1.1 試驗(yàn)材料蘋果木質(zhì)部及韌皮部材料采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害流行與綜合防治試驗(yàn)園,分別取富士蘋果樹的主干、1年生枝條

3、、2年生枝條和3年生枝條的木質(zhì)部及韌皮部,放入保鮮袋中并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室,放于-80C超低溫冰箱中保存,備用.1.2 方法1.2.1 改進(jìn)的CTABS6將樣品參加適量的石英砂,加液氮研磨,取適量植物組織粉狀裝入2mL無(wú)菌的離心管中備用.向離心管中參加65C預(yù)熱的2%CTAB抽提緩沖液14mol/LNaCl,1mol/LTris-HCLpH值8.0,20mmol/LEDTA2%CTAB2%PVPP2海-航基乙醇650以L,渦旋混勻,65C水浴1h,每隔10min輕輕顛倒離心管1次,使研磨后的粉末和抽提緩沖液充分混勻.向離心管中參加650以L的酚-氯仿-異戊醇體積比25：24：1,渦旋混勻,并于4C

4、、12000r/min離心15min.將上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管中,向其中參加等體積的氯仿混均勻,于4°C、12000r/min離心10min.吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中,向其中參加60以L的3mol/LNaAc,和200以L異丙醇,混合均勻,-20C放置1h,12000r/min離心10min,倒出上清液.用300以L冷凍保存70雙醇清洗沉淀2次,無(wú)水乙醇沖洗1次,最后于室溫條件下枯燥,向離心管中參加100以LTEpH值8.0,4C放置過夜待DNAlS全溶解,于-20C保存?zhèn)溆?1.2.2 改進(jìn)的快速鹽提法7在樣品中參加適量的石英砂,加液氮研磨,取適量粉狀植物組織裝入2mL

5、無(wú)菌的離心管中備用.每管參加提取緩沖液1.0mol/LNaCl,100mmol/LTris-HCl,pH值8.0,50mmol/LEDTApH值8.0400以L,用塑料棒旋轉(zhuǎn)碾碎后加40lL20%SDS振蕩混勻30s.將樣品放于65C水中溫育2h,向每管參加3006mol/LNaCl,振蕩混勻30so12000r/min離心10min,將上清轉(zhuǎn)入干凈的離心管中,參加等體積預(yù)冷的異丙醇,輕柔混勻后-20C冰箱放置1ho12000r/min離心10min,小心將上清液倒出,分別用70雙醇和純乙醇各洗1次后,晾干.將DNA羊品溶解于100以L滅菌的蒸儲(chǔ)水中,-20C保存,備用.1.2.3 試劑盒法采

6、用植物組織基因組DNAI取試劑盒EasyPurePlantGenomicDNAKit,北京全式金生物公司進(jìn)行木質(zhì)部和韌皮部組織基因組DNA勺提取,嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書上提供的方法進(jìn)行操作,最后提取的基因組DNAf-20C保存,備用.1.3 DNA的質(zhì)量檢測(cè)1.3.1 DNA濃度的測(cè)定和純度檢測(cè)采用K5500超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定及純度檢測(cè).DNA羊品的濃度一般可根據(jù)其在260nm的吸光度來(lái)確定,純度檢測(cè)通過D260nm/D280nm來(lái)確定.1.3.2 DNA質(zhì)量的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分別取5以LDNA樣品和1jiL的6XLoadingbuffer,混勻后經(jīng)1.2%朝旨糖凝膠電泳檢測(cè),檢

7、測(cè)使用Marker為寶生物工程大連XX公司的DL2000DNAMarker,電泳電壓為110V,時(shí)間為40min.電泳結(jié)束后進(jìn)行澳化乙錠EB染色,最后經(jīng)SYNGENE!膠成像儀觀察照相.1.3.3隨機(jī)引物PCFT增隨機(jī)引物擴(kuò)增反響使用30以L反響體系2XEsTaqMasterMix15以L,弓I物1以L,DNAB板1lL,ddH2O13以L.其中,隨機(jī)引物為上海生工生物工程技術(shù)效勞XX公司2000多條引物中隨機(jī)挑選的1條.擴(kuò)增程序：94C預(yù)變性5min;94C變性30s,35C退火30s,72C延伸90s,共40個(gè)循環(huán)；最后72C延伸10min,4C保存.2結(jié)果與分析2.1DNA濃度的測(cè)定和純

8、度檢測(cè)由表1可以看出,改進(jìn)的CTA砒提取DNA勺濃度根本能滿足PCRS求,而改進(jìn)的快速鹽提法和試劑盒法提取效果很差,提取DNA導(dǎo)率太低或無(wú)法提出,因而無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn).從表2可以看出,改進(jìn)的CTA砒提取DNA勺D260nm/D280nm為2.062.29,這說明DNAS損程度不高且比擬純,蛋白質(zhì)、酚類及多糖等雜質(zhì)去除效果較好,但D260nm/D280nm大于1.9,說明可能有RNA要求嚴(yán)格的分子生物學(xué)試驗(yàn)可以加一步去除RNA勺操作.改進(jìn)的快速鹽提法和試劑盒法提取DNAWD260nm/D280nm均小于1.6,甚至有的為負(fù)數(shù),這說明蛋白質(zhì)或酚類污染嚴(yán)重,或是未提出DNA綜上,改進(jìn)的C

9、TA砒是適合蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織基因組DNA取的最正確方法.表1蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織提取DNAt度檢測(cè)XX部位提取的DN續(xù)度ng/lL改進(jìn)的CTA砒改進(jìn)的快速鹽提法試劑盒法木質(zhì)部韌皮部木質(zhì)部韌皮部木質(zhì)部韌皮部主干102.1256.612.016.23.37.53年生枝條178.4376.534.946.74.411.22年生枝條228.5566.242.669.21.69.51 年生枝條418.2734.592.397.78.218.9表2蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織提取DNA屯度檢測(cè)XX部位D260nm/D280nm改進(jìn)的CTA砒改進(jìn)的快速鹽提法試劑盒法木質(zhì)部韌皮部木質(zhì)部韌皮部木質(zhì)部韌皮

10、部主干2.292.231.61.00.80.973年生枝條2.112.060.50.51.2-3.702 年生枝條2.152.121.10.50.61.102.1 年生枝條2.102.091.30.61.41.302.2 DNA質(zhì)量的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)從圖1可以看出,用改進(jìn)的CTA砒提取的組織基因組DNA可以看到均有大于2000bp的條帶,但條帶亮度均比Marker要暗,說明所提基因組DN順度均偏低,從條帶亮度也大致可以看出主干的木質(zhì)部以及韌皮部的基因組DN破取質(zhì)量低于枝條組織；而改進(jìn)的快速鹽提法以及試劑盒法提取的基因組DN尚未有明顯條帶,有的泳道可以隱約看到條帶,說明提取質(zhì)量太差或未成功提取

11、到.2.3 隨機(jī)引物PCFT增從圖2可以看出,用改進(jìn)的CTA砒提取的蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部組織基因組DNAS行隨機(jī)引物的PC皈應(yīng)獲得了清楚穩(wěn)定的條帶,進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),均獲得了較好的擴(kuò)增,說明該方法提取的基因組DNA適合進(jìn)一步的分子分析.從圖3可以看出,改進(jìn)的快速鹽提法提取的組織基因組DNAa行隨機(jī)引物的PCRS應(yīng),部分組織也獲得了條帶,但條帶模糊且重復(fù)性不好,因而不太適合進(jìn)一步的分子分析.從圖4可以看出,試劑盒法提取的組織基因組DNAS行的隨機(jī)引物PCRS應(yīng)均未獲得任何條帶,說明此方法可能未提取到DNA3討論高質(zhì)量DN峻求盡量保持核酸分子完整性、高分子量,無(wú)明顯降解現(xiàn)象；還要求純度高,盡量去除酚類

12、等嚴(yán)重干擾酶作用的雜質(zhì)；此外要求獲取效率高,能夠到達(dá)試驗(yàn)要求的濃度8.蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部中含有大量的酚類、多糖等次生代謝物質(zhì),嚴(yán)重影響基因組DNAI取的得率和純度.CTABI取液中參加的PVPP具有酰胺鍵,可吸附多酚分子上的氫氧基從而形成氫鍵,可以吸附多酚,其中參加的B-航基乙醇是一種復(fù)原劑,可預(yù)防細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生褐變,因此,本試驗(yàn)采用的改進(jìn)的CTAE&獲得了較好的提取效果,此外泳道下邊無(wú)拖尾,無(wú)小片段產(chǎn)物,說明未有RNA虧染,這可能是由于提取完DNAW未及時(shí)進(jìn)行電泳檢測(cè),RNA可能已經(jīng)降解.改進(jìn)的鹽提法中參加的1.0mol/LNaCl在減少DNA竄解的同時(shí)可以去除嚴(yán)重降解的DNA9;EDTA可以螯合金屬離子,酶不能與金屬離子結(jié)合,否那么就失去了活性,核酸酶類也是如此,所以EDTA預(yù)防提取DNA寸核酸酶類污染造成DNA勺降解.但該方法依舊未獲得高質(zhì)量的DNA雖預(yù)防了使用酚/氯仿抽提,減少了酚/氯仿對(duì)試驗(yàn)人員的傷害,但提取效果不佳,不建議使用該方法進(jìn)行蘋果樹木質(zhì)部及韌皮部的基因組DNAfg取.試劑盒法為公司開發(fā)的便捷型產(chǎn)品,對(duì)一般植物組織可能通用性較強(qiáng),但是對(duì)于蘋果樹的木質(zhì)部和韌皮部針對(duì)性太差,無(wú)法提取到高質(zhì)量的基因組DNA楊英軍等采用CTAEfe和SDSfe從落葉果樹韌皮部提取DNA認(rèn)為SDS法總體上優(yōu)于CTABS10,但王富榮等11以及