碳煙與腫瘤的發(fā)生及進展的關聯(lián)芻議

1、碳煙與腫瘤的發(fā)生及進展的關聯(lián)芻議北京市海淀區(qū)教師進修學校附屬實驗學校韓鵬飛摘要 在中國大部分地區(qū)常年出現(xiàn)輕中度霾，在特殊時期時常出現(xiàn)重度霾。研究表明，霾為一級致癌物，且中國肺癌發(fā)病率連年上升。對于霾的組成成分及霾與肺病發(fā)生的關系已經(jīng)有了大量研究，但對于主要成分的致病機理尚不明確。本文選擇碳煙這一霾的重要組成成分，利用假說演繹的方法，以碳煙復合體模型及信號傳導異常為核心，從細胞生物學、分子生物學、生物物理學及腫瘤學的角度假設，初步得出了碳煙通過影響信號通路的信息傳導導致細胞周期加快、抑制死亡、逃過免疫機制、促進腫瘤血管生成及轉移，并初步設計實驗驗證本文觀點，為霾導致惡性腫瘤的預防及解決做基礎理論

2、工作。關鍵詞 碳煙 腫瘤 信號傳導 霾是懸浮在大氣中的大量微小塵粒、煙?；螓}粒的集合體，主要由氣溶膠組成，使空氣渾濁，水平能見度降低到10km以下的一種天氣現(xiàn)象。霾的組成成分非常復雜，包括數(shù)百種大氣顆粒物。其中有害人類健康的主要是直徑小于10微米的氣溶膠粒子，如礦物顆粒物、硫酸鹽、硝酸鹽、有機氣溶膠粒子等。直徑小于2.5微米的為細顆粒物，化學成分主要包括有機碳、硝酸鹽、硫酸鹽、銨鹽、鈉鹽等，它能直接進入并粘附在人體上下呼吸道和肺葉中，對人們的健康造成威脅。化石燃料燃燒是霾產(chǎn)生的主要原因之一。2015年底北京等地區(qū)出現(xiàn)了大面積霾污染，供暖期燃煤污染是重要來源，特別是城鄉(xiāng)結合部和廣大農(nóng)村地區(qū)的原煤

3、散燒污染。煤中的微量元素有些是具有毒性，砷、汞、等有毒物質隨煙氣進入大氣，煤在空氣加熱形成揮發(fā)物一氧化碳、硫化氫、氨氣及多環(huán)芳香族碳氫化合物和碳煙等顆粒物。 由上海復旦大學公共衛(wèi)生學院研究了霧霾對生物器官組織破壞。項目組歷時5個月，使用大流量采樣器在上海徐匯區(qū)非工業(yè)區(qū)采用玻璃纖維濾紙采集大氣細顆粒物PM2.5制成顆粒物懸濁液，對實驗大鼠氣管滴注PM2.5懸濁液，建立肺損傷模型并觀測不同對照組的體征、肺重比、各項關鍵生化指標以及鼠肺損傷程度。研究通過大鼠解剖后發(fā)現(xiàn)，PM2.5對照組大鼠經(jīng)過隔天滴注總計6天后（144小時），肺組織變硬，缺乏彈性，呈暗紅色，邊緣色澤灰白，肺組織有明顯可見的黑色顆粒物

4、彌散。研究項目組負責人復旦大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生教研室主任、博士生導師宋偉民教授在接受采訪時表示，“PM2.5顆粒對肺的損傷一旦形成，治療的藥物成本和時間成本就會大大增加，如果形成“黑肺”，徹底消除的難度大大增加，幾乎無逆轉可能?！?研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5進入肺組織后不僅影響肺泡巨噬細胞的吞噬功能，而且會影響肺上皮細胞細胞膜的通透性和流動性，造成細胞內容物漏出，導致細胞死亡。同時，PM2.5會引起肺組織生化成分的改變以及炎癥因子的釋放，誘發(fā)炎癥，嚴重而持久的炎癥會引起組織增生纖維化，導致肺部疾病乃至肺癌的發(fā)生。世界衛(wèi)生組織下屬國際癌癥研究機構指出，有充足證據(jù)顯示，暴露于戶外空氣污染中會致肺癌，

5、接觸顆粒物和大氣污染的程度越深，罹患肺癌的風險越大。 世界衛(wèi)生組織下屬國際癌癥研究機構發(fā)布報告，首次指認大氣污染對人類致癌，并視其為普遍和主要的環(huán)境致癌物。室外空氣中顆粒物污染成為全球第7大死因，中國第4大死因，全球超過300萬人死于該污染引發(fā)的各種疾病，其中中國有123萬多人因此死亡，2400多萬人減壽。每年有近200萬過早死亡病例與PM2.5等顆粒物污染有關。即便在歐盟國家中，由于暴露于人類活動產(chǎn)生的PM2.5 ，人均期望壽命也減少8.6個月。它對人的影響要大于其他任何污染物。*來自于新聞及互聯(lián)網(wǎng)上的文章碳煙與腫瘤的發(fā)生及進展的關聯(lián)芻議結構及內容簡介1.碳煙的形成及特點煤粉燃燒碳煙的形成及

6、結構特點碳煙在人體內的行為制備本文實驗用放射性碳煙2.碳煙與腫瘤發(fā)生的關系(1)碳煙與化學致癌物：碳煙形成的過程出產(chǎn)生的中間產(chǎn)物具有致癌性(2)碳煙與致癌微生物：碳煙的內部提供了一個較為封閉且適合微生物生存的環(huán)境（實驗）(3)碳煙與信號傳導異常1碳煙EGF 復合體的形成：在內環(huán)境中碳煙與 EGF 具有形狀互補、疏水作用、電場作用2對三種復合物的物理分析：應用統(tǒng)計力學討論碳煙EGFR、碳煙EGF、EGFEGFR 的結合概率、粒子數(shù)及解離度（實驗）3RTK 信號通路異常（Ras/MAPK 通路及PI3K/Akt 通路）碳煙EGF 復合體降低了機體對 EGF的滅活程度并隱藏 EGF 不被發(fā)現(xiàn)碳煙、E

7、GF、EGFR 形成的復合體的相互作用（實驗）形成碳煙EGFR 復合體導致受體被占用（實驗）導致 RTK 通路持續(xù)激活，EGF、EGFR 過度表達細胞周期加快，抑制凋亡（實驗）4JAK-STAT 信號通路異常：碳煙復合體影響受體內吞，通路關閉效率降低，作用時間加長，使更多腫瘤細胞逃過免疫5Hegdehog信號通路異常：碳煙Shh 復合體的形成影響 Ptc 的內吞，不能解除對 Smo 的抑制，進而使通路持續(xù)處于失活狀態(tài)，阻止腫瘤形成 （實驗）6 BMP信號通路及生長因子cyclin通路異常: 碳煙通過影響 BMP 通路，使 TGF-過度表達，影響對細胞周期的調控（實驗）。碳煙、EGF、EGFR

8、形成的復合體的相互作用導致 cyclin 過度表達，細胞周期加快（實驗）形成碳煙CDK和碳煙cyclin復合體，導致 CDK、cyclin 過表達，過多靶細胞磷酸化，細胞周期加快7碳煙與 PKC：形成碳煙DAG 復合體，使參加反應的DAG 減少，PKC 活性降低（實驗）3. 碳煙與腫瘤進展的關系(1)碳煙與腫瘤細胞血管生長的關系：EGFR 過表達，導致 VEGF 過表達，形成碳煙、VEGF 與VEGFR復合體，下游持續(xù)激活，促進血管生長(2) 碳煙與腫瘤轉移的關系：碳煙與刺激腫瘤生長、運動、侵襲的因子及受體相互作用，持續(xù)激活下游，形成碳煙MMP 復合體，導致 MMP 過表達，降解 ECM 作用

9、增強，促進腫瘤已侵襲和轉移4.碳煙與腫瘤細胞死亡的關系：形成碳煙TNF 復合物，TNF 與腫瘤細胞持續(xù)作用，同時促進壞死因子，促進腫瘤細胞死亡1.碳煙的形成及特點 化石燃料（以煤為例）燃燒生成的顆粒物大部分為碳煙，主要由碳元素組成。碳煙的形成分為三個步驟。第一步是碳煙前體物的形成，在這個步驟中形成環(huán)狀結構并與乙炔反應長大。在第二步通過化學和凝結作用形成了臨界尺寸（3000-10000原子質量單位）的小顆粒。通過這一步，大分子轉變成顆粒。接下來的第三步中，小的初始碳煙顆粒在隨著燃料流向火焰運動的過程中，不斷暴露在熱解燃料形成的組分中，并不斷長大和聚合。 對于碳煙形成的樣貌問題，由于形成過程的復雜

10、性，會出現(xiàn)很多種聚合碳煙結構。8較小的碳煙顆粒，其內部氧化燃燒形成了中空的納米結構。而碳煙顆粒氧化的各向異性，促進了碳煙顆粒邊緣的石墨化，形成了膠囊狀粒子。 碳煙在空氣中為氣溶膠形式存在，且具有膠體的性質。在溶液中含有與碳煙粒子所帶電荷相反的離子，這些反離子被膠體表面所吸引。這些離子會受到膠體表面排斥，從而傾向于離開膠體表面。最終導致在碳煙粒子周圍總有一團離子云，起所帶的電荷與膠體表面電荷符號相反，但電量恰好相等；膠體粒子連同它的反離子形成一個電中性的體系。碳煙粒子在溶液體系中，既可以以正電粒子的形式，也可以以負電粒子的形成出現(xiàn)。碳煙結構特點總結：存在中空膠囊狀碳煙粒子，在溶液體系中會在粒子表

11、面出現(xiàn)電荷，具有疏水性。霾中的碳煙作為一個超細顆粒，可深入到支氣管及肺泡。當霾進入人體，關于碳煙的行為，據(jù)研究報道，在“細胞自噬”這一細胞的自我保護行為作用下，細胞會試圖通過“自噬”包裹住碳煙等顆粒并降解。然而，由于這些含有大量無機碳、重金屬等有毒物質，很難被細胞自噬降解。在一系列復雜過程下，最終導致了氣道炎癥和粘液的大量分泌，最終引發(fā)慢性呼吸道疾病。當碳煙進入肺泡后，I 型肺泡細胞胞質內有較多的吞飲小泡，內有細胞吞入的微小粉塵，可裝運至間質清除，同時肺泡隔巨噬細胞具有活躍的吞噬功能，能清除異物，之后沉積在肺間質內，有的從呼吸道隨粘液咳出，還有的進入肺淋巴管，在遷移至肺淋巴結。關于本文實驗的碳

12、煙的制備，采用煤粉燃燒火焰區(qū)域中碳煙的結構及行為中的碳煙發(fā)生結構，將通入發(fā)生裝置的空氣換為模擬空氣，由79%N2、21%18O2和稀有氣體組成。收集的碳煙通過放射性檢測，獲得被放射性同位素標記的碳煙。將取樣后的碳煙分級收集，利用超聲波對聚酸碳酯膜上的碳煙進行分散分離，儲存在模擬空氣（氮氣的體積分數(shù)為78%，氧氣的體積分數(shù)為21%，其余為二氧化碳及稀有氣體）或處理過的無生命的空氣中，濃度約為發(fā)生霾時空氣中碳煙的濃度。對于本文實驗中的細胞培養(yǎng)，制備實驗組I及對照組I。取兩份等量人呼吸道上皮細胞于合成培養(yǎng)基及血清中體外培養(yǎng)，其中一份持續(xù)通入制備的含有放射性碳煙的模擬空氣，另一份等時間、等流量持續(xù)通入

13、普通空氣，培養(yǎng)一段時間。2.碳煙與腫瘤發(fā)生的關系*均假設碳煙顆粒已經(jīng)進入內環(huán)境2.1.碳煙與化學致癌物 在碳煙的形成過程中，生成了大量PAH等致癌物。如燃燒中生成的苯并芘釋放到大氣中以后和碳煙等在大氣中的微粒所形成的氣溶膠結合在一起，經(jīng)呼吸道吸入肺部，進而進入肺泡及血液。這些間接致癌物通過細胞色素 P-450等酶代謝活化為最終致癌物，如苯并芘最終代謝為7,8-二氫二羥基-9,10-環(huán)氧化苯并芘。這些最終致癌物通過與 DNA 分子加合，對 DNA 分子進行修飾或抑制DNA修復，致使DNA在合成期突變率增加，導致基因的不可逆損傷，開啟細胞惡性轉化。同時，在煤燃燒時，還存在微量著鈹、鎘、砷等有毒物質

14、隨空氣進入呼吸道，這些物質也能導致腫瘤的發(fā)生及惡化。2.2.碳煙與致癌微生物 微生物感染是人類發(fā)生腫瘤的重要原因之一，由微生物引發(fā)的腫瘤占整體腫瘤發(fā)生率的20%左右，EB 、HBV 、HCV 、HPV 、HP 等病毒均為人類常見致瘤病毒。中空膠囊狀碳煙提供了一個空間，可以讓微生物在其中生存，可以儲存一些物質，如體液等，并有可能保護微生物逃過機體免疫。存在的問題。中空膠囊狀碳煙的內部空間能否提供病毒等微生物生存的所需的條件。實驗A：取一定體積的人體液于體外封閉環(huán)境，保持濕度45%55%、溫度25（人最適環(huán)境）。將碳煙空氣通入體液環(huán)境中，充分混合一段時間。將混合后的體液分散，分離出碳煙顆粒，獲得碳

15、煙體液混合物。在體外培養(yǎng) EB 病毒，將碳煙顆粒與病毒充分混合一段時間，再次分離出碳煙顆粒。體外培養(yǎng)人 B 淋巴細胞，將碳煙與細胞混合后培養(yǎng)。不同時間取樣，檢測 EB 病毒數(shù)量。由于 EB 病毒只能在 B 淋巴細胞中增殖，若結果顯示病毒數(shù)量增多，則可判斷該病毒可以在碳煙中生存。 （以EB 病毒為例）2.3.碳煙與信號傳導異常2.3.1. 碳煙 EGF復合體的形成*僅以 EGF 為生長因子代表 EGF ，等電點4.6，分子量6045Da，由53個 AA 殘基組成的分子多肽，含有3個鏈內二硫鍵。N端天冬酰酸（受體結合），C端為精氨酸，具有較高的穩(wěn)定性，其二級結構只有折疊，三級結構為致密環(huán)狀，片層占

16、25%。無規(guī)則卷曲占75%。且分子結構較為柔軟，多肽鏈上幾乎所有殘基的芳香側鏈都在分子表面成簇存在，形成疏水的袋。EGF 在人體體液中解離為陰離子，同時顆粒表面其他親水集團，吸引水分子，形成水化膜。911 碳煙可以與 EGF 形成碳煙EGF復合體。首先，中空膠囊狀碳煙粒子與 EGF 具有形狀互補的結構，有利于形成復合體。其次，碳煙粒子與 EGF 之間有靜電作用。碳煙粒子具有正電，EGF 解離為陰離子，兩者通過電場作用結合形成復合體。且碳煙粒子不溶于水，其中的有機結構具有疏水性質， EGF 中具有親水及疏水集團，兩者通過疏水作用結合。從而形成了碳煙EGF 復合體。2.3.2對三種復合體（碳煙EG

17、F、碳煙EGFR、EGFEGFR）的物理分析 正常人血液中EGFR 濃度51.2 ng/ml2，即2.8×10-10mol/L ，EGF 濃度190.17 ng/L3 ，即 3×10-11mol/L。冬季北京日平均 PM2.5濃度108 g/m3 4，其中碳煙屬于次生有機碳，碳煙顆粒多為球狀及膠囊狀，假設膠囊狀占碳煙顆粒總量的50%， 約占PM2.5總量的6%7%5，即濃度約為7 g/m3，取納米結構碳煙顆粒質量4×10-18 g，則濃度約為3×10-14mol/L。（以上關于碳煙的數(shù)據(jù)來自網(wǎng)絡及不同文獻，本文可能存在引用或處理錯誤）將細胞視為力學及化學

18、平衡的系統(tǒng)，于是可以利用統(tǒng)計力學探究配體及受體的一些問題。需要討論的問題有：（1）復合體的結合概率；（2）復合體的解離率。1用玻爾茲曼分布考慮配體受體結合的概率 p。p=狀態(tài)結合狀態(tài)結合+狀態(tài)未結合引入配體受體結合能b ，配體在溶液中的能量sol ，=1/kBT，取 T=310.15K，則 =2.3×1020 J-1，做盒子模型，受體在盒子里，系統(tǒng)允許的盒子數(shù)，配體數(shù) L，由此得到配分函數(shù)，即概率的分母，ZL,=e-Lsol!L!(-L)+e-Lbe-(L-1)sol!L-1!-L-1! 通過近似處理，引入=b-sol，參考濃度 c0=/Vbox，通常取1mol/L，配體濃度c=L/

19、Vbox，得到p的表達式，p=cc0e-1+cc0e- 碳煙和受體結合與EGF和受體的作用是競爭關系，設=x·kBT，為使趨勢比較更明顯，將 p 擴大一定倍數(shù)，做出 p(x)曲線。p與的關系比較大，當-較大時，p 趨近于1；在一定的范圍內，EGF與受體結合的概率高于受體與碳煙的結合概率。由上文分析得知，碳煙與受體有更多的作用力，放出的能量較多，但具體需要實驗判斷能量范圍，從而確定概率。 EGF與受體和碳煙與 EGF 的結合同樣是競爭的關系，p(x)曲線與上圖相似。由上文分析，碳煙與 EGF 的結合放出的能量較多，但具體需要實驗判斷能量范圍，從而確定概率。2應用化學熱力學定律，考慮配體

20、受體反應L+RLR，dU=TdS-pdV+dN當化學反應進行時Ni的變化 ， dN=i ，其中為微量，i為變化的克分子數(shù)。對于上述反應 v L=vR=-1，vLR=1。當均勻系統(tǒng)達到平衡后，外界與它沒有物質交流，則只能有兩個獨立變數(shù)iii=0由已知，i=i0+kBTlncicio得到質量作用定律，并定義解離常數(shù)Kd（可實驗測得）。1Kd=i=1Ncii=(i=1Nci0i)e-ii0i/kBT并有，Kd=LRLRKd的取值范圍為0Kd1，則配體受體復合物的濃度為，LR=LRKd 對于碳煙EGF、碳煙EGFR、EGFEGFR，三者的濃度都很小，當解離常數(shù)趨近于0的時候，復合體才能與單體處于同一數(shù)

21、量級。 關于本節(jié)中物理數(shù)據(jù)的獲取，應用ITC 的方法測量：碳煙EGF、碳煙EGFR、EGFEGFR的摩爾結合焓及解離常數(shù)。2.3.3. RTK 信號通路的異常 EGFR，是配體 EGF 的受體，是原癌基因 C-erbB-1的表達產(chǎn)物，具有酪氨酸激酶活性，廣泛的分布于哺乳動物的上皮細胞，定位于細胞膜上。 第一，當形成復合體的時候，碳煙的中空膠囊狀的結構對結構柔軟的 EGF 是一種保護，避免 EGF 與外界環(huán)境接觸，降低了對 EGF的滅活程度。當 EGF 與 EGFR 解離后，碳煙EGF 復合體依然存在，EGF 未能被滅活，而由于碳煙的存在，機體有可能不能發(fā)現(xiàn)還存在著 EGF，通過負反饋調節(jié)，由基

22、因正常的轉錄翻譯出的 EGF 分子。假如，繼續(xù)形成碳煙EGF 復合體，由于 EGF 的分子量較大，結構較復雜，使得復合體同樣具有 EGF 活性。由此，導致了機體內出現(xiàn)大量的有活性的 EGF，并且碳煙EGF 復合體與單獨 EGF 都能與 EGFR 結合，導致產(chǎn)生更多的 EGFR。第二，碳煙微粒具有電性，有一定概率可以與受體蛋白成鍵，加強柔軟的 EGF 與受體的作用力，保護EGF 與受體之間的作用并導致有可能持續(xù)與受體作用，在沒有蛋白激酶 C 的調節(jié)下，持續(xù)激活下游通路。 第三，當碳煙與單獨的受體蛋白成鍵，導致受體被占用，轉錄出更多的 EGFR。 Ras/MAPK通路：首先， 部分配體EGF與所有

23、受體 EGFR作用，為使剩余的配體與受體作用，原癌基因 C-erbB-1加快轉錄進而翻譯出更多的 EGFR。此時，有超過正常數(shù)量的配體受體復合物。EGF 介導二聚化，并磷酸化EGFR 胞內區(qū)的酪氨酸殘基。然后 EGFR 與接頭蛋白 Grb2中介導信號分子與含磷酸酪氨酸的蛋白分子結合的 SH2結構域結合，Grb2中介導信號分子與富含脯氨酸的蛋白分子結合的 SH3結構下游的 SOS結合，SOS 從血漿中招募 Ras-GDP 至細胞膜，使之轉化為活性的 Ras-GTP，激活下游的 Raf、MAPKK、MAPK。6由于配體受體復合物過多，更多活化的 MAPK 進入細胞核，通過磷酸化作用激活轉錄因子，調

24、控細胞周期，加上上文所述的通路持續(xù)激活，使得細胞增殖周期變短，細胞分裂變快。細胞周期是嚴格按照順序執(zhí)行的。細胞在分裂中有一系列避免發(fā)生錯誤機制。由于磷酸化增多，導致其失調，使本來應停止的增殖或發(fā)生凋亡的細胞沒有正常作用，致使 DNA 損傷或復制錯誤未能及時糾正，細胞就會帶著錯誤信息進入周期循環(huán)而造成惡變。此種碳煙復合體導致的結果，發(fā)生 DNA 突變或其他機理導致癌變的細胞繼續(xù)增殖，腫瘤持續(xù)惡性發(fā)展。同時，原癌基因C-erbB-1 過度表達，從而導致腫瘤的形成。 PI3K/Akt 信號通路：生長因子通過刺激PI3K/Akt通路刺激 Akt 的活化。同上文所述，碳煙EGF復合體的出現(xiàn)，形成較正常水

25、平較高的配體受體復合物，導致信號通路的過度活化。當 Akt 被過度激活后，能夠向細胞質或細胞核轉運，并與相應部位的底物蛋白發(fā)生作用，使底物蛋白特定部位的絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化而激活或滅活底物蛋白，從而抑制細胞凋亡。13同時，Akt 磷酸化 GSK3和 mTOR ，從而上調 cyclin D，以及磷酸化一系列抑制蛋白，加快細胞周期。 存在的問題。第一，碳煙與 EGF 復合體的結合程度及結合穩(wěn)定程度，與其他作用力相比，是否存在拮抗的作用而影響復合體的形成及分解。第二，受體 EGFR胞內區(qū)的第645位蘇氨酸殘基的磷酸化作用調節(jié)受體激酶活性，其可被蛋白激酶 C 磷酸化，由此降低該受體對配體的親和力，

26、使配體通過受體活化酪氨酸蛋白激酶的作用減弱。這種作用是否能調節(jié)上述信號通路異常。第三，解離后的碳煙EGF 復合體的結合程度，能否被機體發(fā)現(xiàn)解離后的 EGF 未被滅活，有多少沒有被機體發(fā)現(xiàn)。第四，EGFR 及 EGF的過度表達程度有多少。第五，其他作用于 RTK 通路的生長因子，由于配體蛋白的結構和功能不同，是否均有同樣的作用。第六，碳煙與受體結合的趨勢能對配體受體復合物多少作用力，對復合物解離的影響有多大。 實驗B：利用抗原抗體反應、同位素標記及熒光標記等方法，檢測在碳煙影響下RTK 信號通路中EGFR 的磷酸化情況。i/制備無 EGF的血清。提取人表皮生長因子（EGF），將一定量的 EGF注

27、入小鼠體內，使小鼠 B 淋巴細胞產(chǎn)生EGF 的抗體。利用單克隆抗體技術，獲得大量EGF抗體。向血清中加入一定量的 EGF 抗體一段時間，將抗原抗體復合物沉淀，去除血清中的 EGF。ii/制備含同位素標記的 EGF的血清。找出人細胞編碼EGF基因片段，通過基因工程的方法，并用含15N的唯一氮源培養(yǎng)，獲得同位素標記的EGF。將同位素標記的 EGF 加入到上步制備的無普通 EGF 的血清中，且EGF 濃度為3×10-11mol/L。iii/制備碳煙影響下的細胞。制備一定量的 32P標記的磷酸，加入到合成培養(yǎng)基中。利用處理過的血清及合成培養(yǎng)基，分為實驗組II和對照組II，體外培養(yǎng)人呼吸道上皮

28、細胞，并置于一封閉空間內，同時持續(xù)緩慢地通入空氣。將實驗組的普通空氣換為上文所述制備的含有放射性碳煙的空氣，通入封閉空間內一段時間同時對照組通入等量普通空氣。iv/取一定量實驗組的細胞，顯微觀察膜外相鄰有多處高放射性的位置且放射性強度不同并標記在膜上；取一定量對照組的細胞，顯微觀察膜外有一處高放射的位置并標記在膜上。觀察兩組標記位置的胞內放射強度，記錄高放射性存在的時間。v/比較實驗組和對照組的高放射性存在的時間。 高放射性存在的時間，對應為 EGFR 活化的時間。若實驗組的時間較長，則證明形成的碳煙EGF 復合體影響了 RTK 信號通路，使其持續(xù)激活。 實驗C：探究碳煙EGFR復合體數(shù)量及膜

29、上 EGFR 受體數(shù)量。i/制備EGFR胞內區(qū)蛋白的熒光標記抗體。分離獲得EGFR胞內區(qū)，通過上文的方法制得有熒光標記的單克隆抗體。ii/取一定量的細胞，加入大量蒸餾水，使細胞漲破并分離細胞器與細胞膜。取一定量的細胞膜，分為實驗組及對照組。實驗組為通入含放射性的碳煙空氣，對照組為等時間、等流量通入的普通空氣，一段時間后加入EGFR胞內區(qū)蛋白抗體。顯微下觀察熒光并標記位置，檢測標記位置的放射性強度。統(tǒng)計實驗組一個細胞高放射性點的數(shù)量，即碳煙EGFR復合體數(shù)量。統(tǒng)計實驗組與對照組細胞膜上的熒光標記數(shù)量。即EGFR數(shù)量。 實驗D：探究碳煙對細胞內 Ras、Akt 等酪氨酸蛋白激酶介導的信號通路中的蛋

30、白含量的影響。i/制備實驗組I及對照組I。ii/制備熒光標記的通路蛋白抗體。iii/ 加入抗體培養(yǎng)一段時間后，加入大量蒸餾水，使細胞吸水脹破，分離得到胞漿溶液。iv/顯微觀察實驗組及對照組的熒光數(shù)量。若實驗組數(shù)量大于對照組，即證明碳煙使 RTK 通路過度激活，細胞周期加快，抑制凋亡。2.3.4. JAKSTAT 信號通路異常 JAKSTAT 通路主要由細胞因子（如白介素27，EGF，INF）激活，在正常細胞中，該信號通路激活后對 STAT 的激活是快速且短暫的，受體內吞為關閉方式之一。當碳煙與細胞因子形成復合體時，由受體介導內吞作用，但由于配體被碳煙外殼的保護并形成大的顆粒結構，無法降解配體，

31、所以只能依靠JAK/STAT信號通路激活誘導表達的細胞因子信號轉導抑制蛋白家族的負反饋調節(jié)關閉通路，導致關閉效率降低。 配體受體結合后引起受體分子的二聚化，當關閉效率降低時，與受體偶聯(lián)的 JAK 激酶相互接近并通過交互的酪氨酸磷酸化作用而持續(xù)活化。JAK 激活后催化受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾，繼而這些磷酸化的酪氨酸位點與周圍的氨基酸序列形成停泊位點，同時含有 SH2結構域的 STAT 蛋白被招募到停泊位點。之后，激酶 JAK 催化結合在受體上的 STAT 蛋白發(fā)生磷酸化修飾，持續(xù)活化的 STAT 蛋白以二聚體的形式進入細胞核內與靶基因結合，調控基因轉錄。13JAK/STAT 通路的持續(xù)激

32、活，使腫瘤細胞具有了免疫逃逸功能，降低機體對腫瘤細胞的免疫殺傷功能。 存在的問題。當受體介導的內吞作用減弱時，依靠JAK/STAT信號通路激活誘導表達的細胞因子信號轉導抑制蛋白家族的負反饋調節(jié)關閉通路，此時關閉效率有多少降低，降低能使 STAT 蛋白持續(xù)活化的時間較正常相比相差多少，這些都有待進一步討論。2.3.5.Hedgehog 信號通路異常 Hh 信號通路主要由Hedgehog配體（Shh）、跨膜蛋白受體 Ptch 和 Smo 和下游轉錄因子 Gli 蛋白等。在沒有配體刺激下，Ptch 和 Smo 結合在一起，Ptch 抑制 Smo 的活性，此時信號通路失活狀態(tài)。當出現(xiàn)Hedgehog配

33、體時，配體與受體 Ptch 結合后，解除了 Ptch 對 Smo 的抑制，引發(fā) Smo 移向細胞表面，此時的Smo 引發(fā)下游信號，激活轉錄因子 Gli。當形成碳煙Shh 復合體時，由于碳煙與受體的作用，使得有相互結合的趨勢，當碳煙Shh復合體時， Shh 與Ptc 結合后不能內吞入細胞使 Ptc 被降解，進而不能解除對 Smo 的抑制。在沒有其他蛋白調控的情況下，使下游轉錄信號不能激活，抑制腫瘤的形成。 存在的問題。碳煙Shh 復合體被內吞的程度影響了 Smo的活性，進而影響轉錄。 實驗E：探究碳煙對Hedgehog 信號通路活性的影響。利用熒光標記的抗原抗體反應，檢測細胞表面 Smo 的數(shù)量

34、。i/制備熒光標記的 Smo 抗體。ii/取實驗組I和對照組I，加入上步制備的抗體，培養(yǎng)一段時間后，觀察熒光數(shù)量。若對照組數(shù)量高于實驗組，即實驗組細胞表面 Smo 數(shù)量減少，則證明碳煙降低了 Hh 通路活性。2.3.6. BMP信號通路及生長因子cyclin通路異常 BMP 是 TGF-超家族重要成員。若形成碳煙BMP 復合體，同上文所述， 導致 BMP、BMPR 過度表達，通路活化時間加長。當 BMP與受體結合后，BMPR2磷酸化 BMP1，活化的 I 型受體通過胞內區(qū)段的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，磷酸化 R-Smad C 端的絲氨酸殘基，并將信號進一步傳給細胞內的 Smad，進而影響細胞轉錄

35、及增殖。過度表達的TGF-調節(jié) CKI 的表達，影響細胞周期，同時，通過誘導一些轉錄因子的表達，促進了上皮間充質轉化。 細胞周期調控機制的核心是CDK和cyclin 形成復合物，引起關鍵的靶蛋白發(fā)生磷酸化，促進細胞進入細胞周期。當形成碳煙CDK 復合體和碳煙cyclin復合體時，兩個結構結合后，兩個中空膠囊狀碳煙形成結合結構，導致內環(huán)境內游離的 CDK 和cyclin 減少。通過負反饋調節(jié)，產(chǎn)生正常數(shù)量的兩種游離的蛋白，其與兩種碳煙復合體同時作用，形成超過正常數(shù)量的磷酸化，周期加快。 未受到生長因子刺激時，CKI 通過抑制 cyclinCDK 復合物的活性，使 Rb 保持去磷酸化狀態(tài)，去磷酸化

36、的 Rb 與 E2F 形成復合物，阻斷了 E2F 的轉錄活性。生長因子通過與其受體的作用，通過信號傳遞促進 cyclin 基因表達，cyclin 與相應的 CDK 結合為激酶復合物對 Rb 進行磷酸化；磷酸化的 Rb 釋放 E2F，推進細胞周期。同上文所述，當形成碳煙生長因子復合體時，cyclin 基因過度表達，引起更多的 Rb 磷酸化，大量的 E2F 調控細胞周期。 存在的問題。當形成碳煙CDK 和碳煙cyclin復合物后，生物活性集團有多少能露在碳煙顆粒外面，引起靶蛋白磷酸化。 實驗 F：同實驗 D，利用熒光標記的抗原抗體反應探究碳煙對胞漿 CKI 含量的影響，若實驗組少于對照組，則證明碳

37、煙抑制細胞周期抑制蛋白，細胞周期加快。 實驗 G：同實驗 B，利用熒光標記的抗原抗體反應及同位素標記探究在碳煙影響下 BMPR 的磷酸化情況。2.3.7.碳煙與PKC PKC可通過兩種途徑參與基因表達的控制。一種途徑是蛋白激酶激活一個磷酸化的級聯(lián)系統(tǒng)，使MAP蛋白激酶磷酸化，磷酸化的MAP蛋白激酶將基因調節(jié)蛋白Elk-1磷酸化，使之激活。激活了Elk-1與SRE結合，然后與SRF共同調節(jié)基因表達。另一種途徑是蛋白激酶磷酸化并激活抑制蛋白I-B，釋放基因調節(jié)蛋白NF-B，使之進入細胞核激活特定基因的轉錄。 PKC廣泛分布于多種組織、器官和細胞，靜止細胞中PKC主要存在于胞漿中，當細胞受到刺激后，

38、PKC以Ca2+依賴的形式從胞漿中移位到細胞膜上，此為激活的標志。PKC的活性依賴于鈣離子和磷脂的存在，由于DAG能增加PKC對底物親和力，所以只有DAG 的存在下，生理濃度的鈣離子才起作用。PIP2在磷脂酶-C作用下水解生成DAG和IP3。IP3促進細胞內鈣離子的釋放，在激活PKC過程中與DAG起協(xié)同作用。 DAG，二酰甘油，一分子甘油與兩分子脂肪酸酯化形成的甘油酯，是一種小分子量的分子，與碳煙顆粒的分子量相比相差很大，與碳煙中空膠囊狀結構有一定的結構互補，且具有一定的疏水性及靜電作用。從而，形成碳煙DAG 復合體，可能被碳煙完全包裹住，使得機體內的游離的DAG 大量減少。由于穩(wěn)態(tài)的負反饋調

39、節(jié)，細胞產(chǎn)生正常數(shù)量的獨立DAG，進而又形成碳煙DAG 復合體。由于 DAG 的分子量較小，結構較簡單，導致DAG 數(shù)量的減少使得PKC 活性下降，從而影響了細胞核轉錄，影響細胞分化和增殖。 存在的問題。第一，由于二者形狀結構相差較大，碳煙對 DAG 分子的包裹程度。第二，機體對碳煙DAG 復合體能否體現(xiàn) DAG 活性，且能否發(fā)現(xiàn)復合體的 DAG 活性。 實驗H：探究碳煙對PKC活性的影響。同實驗 D，利用熒光標記的抗原抗體反應，檢測PKC的數(shù)量。若對照組數(shù)量高于實驗組，則碳煙使活性 PKC數(shù)量減少，降低了 PKC 活性。3.碳煙與腫瘤發(fā)展的關系3.1.碳煙與腫瘤細胞血管生長的關系 由上文RT

40、K 信號通路的異?？芍?，碳煙可以使得腫瘤細胞的 EGFR 等過度表達，導致 VEGF 高表達。VEGF 是一種很強的有絲分裂原，促進內皮細胞移動、增殖。同時，VEGF 可以改變血管內皮細胞的基因表達方式，有利于新血管生成及延長血管內皮細胞壽命。當 VEGF 與 VEGF-R 結合后，受體二聚化。若形成碳煙VEGF 復合體，同上文所述，配體受體復合物作用時間加長，下游信號持續(xù)激活，促進血管的形成，增加血管的通透性，促進營養(yǎng)物質進入，有利于腫瘤細胞生長和增殖。（實驗、問題同上文 RTK 通路）3.2.碳煙與腫瘤轉移的關系 腫瘤細胞的運動的促進與抑制與碳煙形成的復合體有關。許多因子可以促使腫瘤細胞運

41、動，這些因子影響腫瘤細胞表面受體的分布，通過改變受體與配體間的結合密度來協(xié)調細胞的黏附與去黏附的周期過程，調節(jié)細胞與細胞之間、細胞與基質之間的黏合。首先，若碳煙與能刺激腫瘤細胞生長、運動和侵襲的因子形成復合體，可能持續(xù)激活下游。其次，如上文所述，腫瘤細胞的生長因子高表達。故，碳煙對腫瘤轉移是促進作用的。關于 MMPs 對 ECM 的降解作用。形成碳煙MMP 復合體，通過上文中所述機制，產(chǎn)生過量的 MMP，導致 ECM 的降解作用增強，促進腫瘤細胞的轉移。 存在的問題。碳煙與運動、侵襲的因子及 MMP復合體一系列問題（同上文碳煙EGF 復合體。4.碳煙與腫瘤細胞死亡的關系 在細胞凋亡的過程中，T

42、NF 及其受體家族在細胞凋亡中起到關鍵作用。如上文所述，碳煙通過與 TNF 形成復合體，使TNF 與腫瘤細胞作用時間加長，促進了其凋亡。 同時，TNF 刺激，可誘導促壞死復合體 RIP1-RIP3的形成，從而活化多種壞死介質。在 mTOR 通路中，碳煙對生長因子的影響導致激活持續(xù)活化，抑制了細胞凋亡；在細胞自噬機制下，mTOR活化抑制細胞自噬，使腫瘤細胞無法應對代謝壓力而死亡，具有拮抗作用。5. 從物理學角度考慮腫瘤組織的形成5.1.量子糾纏對腫瘤組織的形成的作用 腫瘤的發(fā)生于原癌基因的表達有關。當一個正常的原癌基因激活時，它就具備了轉化為腫瘤細胞的能力。假設細胞內存在不同的種類的量子狀態(tài)的結

43、構，這些結構能控制細胞的一些功能。應用量子糾纏理論，考慮這個量子態(tài)結構控制的是否可能是基因。若在細胞中一種量子態(tài)的結構，這些結構調控基因的選擇性表達及細胞分化。當一個細胞的量子態(tài)結構使其分化表達為 A 類細胞時，通過量子糾纏效應，使與其糾纏的細胞也分化表達為 A 類細胞，從而形成由大量有特殊功能的細胞的組織，如上皮組織、結締組織等。于是，可以從這個角度討論一個腫瘤細胞通過其中的量子態(tài)結構使另一個細胞的量子態(tài)結構所控制的基因選擇性表達發(fā)生變化，從而使正常細胞的原癌基因表達，導致其變?yōu)槟[瘤細胞。5.2.電磁波對腫瘤組織的形成的作用 腫瘤可以說是一種細胞周期性疾病，其特征之一即為增殖迅速，由此使細胞

44、內的蛋白質、核苷酸、脂質、無機鹽等含量及一些結構與正常細胞不同。腫瘤細胞的僅由糖酵解作用釋放能量，使得與正常細胞的電子傳遞也不同。在細胞膜上的離子通道，會有相應的離子電流；在蛋白質分子和水中質子沿氫鍵鏈或環(huán)的定向運動產(chǎn)生質子電流；電子在線粒體、DNA 上的遷移，也會產(chǎn)生磁性；生物組織內中也有磁性的元素及化合物，幾種金屬都具有順磁性而這些物質都具有自己不同的電磁特性。細胞內的電性多以偶極子方式呈現(xiàn)，腫瘤細胞內部的某些場的強度、熱效應等物理指標與正常有區(qū)別。由此，在不斷不均勻變化的電場和磁場中，由細胞產(chǎn)生并發(fā)生了微弱的電磁波，其中由 DNA 的電子遷移引起的電磁效應是較為重要的，其可能影響了基因的

45、選擇性表達，同理由正常細胞 A轉化的腫瘤細胞 A 的電磁波的各項指標會變化。 在上皮組織中，若正常細胞內的各物理量為a i，其表現(xiàn)了該細胞的生理狀態(tài)，由于正常上皮細胞功能相似，ai也是相似的，而由正常細胞轉化生成的腫瘤細胞，由于發(fā)生惡性增殖的途徑不同，腫瘤細胞內部的結構及化合物含量亦不同。則記腫瘤細胞的 各物理量為bij。當兩種細胞發(fā)出電磁波時，發(fā)生干涉效應，得到干涉后的電磁波的物理量不同于以前的兩個。同時，各個細胞也在接受從外界來的電磁波等物理信息，影響這細胞內部生化反應。因此，應該對活性的正常生物組織、腫瘤組織及單個正常細胞、腫瘤細胞的電磁特性做探測。主要研究分析的內容有三點。(i=1,2,3