對已知基因序列的干擾素

1、對已知基因序列的干擾素 , 基因文庫的調(diào)用可以用其序列 3' 端和 5' 端部分事先用同位素標(biāo)記過的序列作為探針 , 通過雜交的方法進(jìn)行調(diào)用。由于干擾素基因的種屬特異性不是很大 ,| 可以用人的干擾素基因為同源探針 , 從鼠基因文庫中調(diào)出相應(yīng)的干擾素基因 , 其方法將在下文 1 中提到。 |對于擾素基因的取用 , 不僅可以使用構(gòu)建基因文庫的方法 , 對已了解其氨基酸或核昔酸割成的干擾素也可以用化學(xué)合成的方法先合成其編碼的 DNA 序列 , 再對其進(jìn)行表達(dá)?；瘜W(xué)合 | 成方法包括固相合成法及液相合成法兩大類。與利用基因文庫的方法相比 , 化學(xué)合成法比較 | 復(fù)雜 , 由于每加入一

2、個核昔酸就會有一定比例的錯誤摻入、基因重疊、基因缺失等情況 , 并且在 l 整個合成過程中這種錯誤不斷積累 , 因此該方法適合比較短的基因 , 而對長的基因則有目的產(chǎn) | 物含量低、產(chǎn)物純化困難的缺點。但它也有優(yōu)點 , 如可根據(jù)研究的需要對一些氨基酸進(jìn)行定點 | 突變 , 或根據(jù)宿主菌的特性 , 在不改變其氨基酸組成的情況下使用宿主的偏愛密碼子 , 以提高 | 產(chǎn)物的產(chǎn)量。 |對于不同亞型的干擾素 , 由于同源性較高 , 可以用相同的引物從誘導(dǎo)的小鼠細(xì)胞系中提取mRNA 混合物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增 , 然后用亞型特異性探針對 CDNA 混合物進(jìn)行 Southern 印跡 , 這樣便可將序列上相差較

3、小的同種、不同亞型的干擾素基因進(jìn)行分離 , 為生產(chǎn)高純度的單一干擾素提供了方法 O三、表達(dá)方法隨著對干擾素研究的深入 , 人們了解到鼠干擾素的抗病毒活性主要位于氨基酸序列上的1040 位、 78107 位、 123166 位的 A 、 B 、 C 區(qū) , 尤其是位于 78 和 79 位的氨基酸對抗病毒 | 活性十分重要。而人 IFNt1 的 121136 位對抗病毒活性作用較大 , 人 IFN 子的 N 端 10 個集 | 基酸也是保持其活性所必需的。對干擾素結(jié)構(gòu)的了解為更好地構(gòu)建基因表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。干 | 擾素最初是用其外源序列進(jìn)行表達(dá)的 , 但近年來的研究表明嵌合表達(dá)的干擾素往往優(yōu)于單一干

4、擾素 , 因此出現(xiàn)了較多的嵌合表達(dá)形式 , 并取得了較好的效果。1.IFN- 的表達(dá)家蠶作為一種用于表達(dá)外源基因的宿主有易于養(yǎng)殖、生產(chǎn)周期短、夕陽基因表達(dá)量高的優(yōu)點 , 同時由于家蠶為真核生物 , 能對表達(dá)產(chǎn)物自行進(jìn)行糖基化修飾 , 產(chǎn)生有生物活性的蛋白 , 并且在產(chǎn)物提取的過程中只要將家蠶進(jìn)行勻漿 , 再進(jìn)行抽提即可 , 操作上十分方便 , 因此 , 它在基因工程領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。下面便以人 IFN, 的生產(chǎn)為例介紹家蠶表達(dá)體系在干擾素生產(chǎn)中的應(yīng)用。用家蠶核型多角病毒 BIIINPV 體外感染的家蠶傳代細(xì)胞株 BM-N 通過噬菌斑法純化得到 BmNPV 的 3 亞型。利用從感染脂肪體 mRN

5、A 制得的 CDNA 為探針 , 對其多角蛋白序列進(jìn)行檢驗 , 其中 10.5kb 的 EcoR I 片段及 3.9 燦的 HindE 片段可與探針雜交 , 將 10.5 燦的 EcoR I 片段克隆到 pBR322 中 , 產(chǎn)生質(zhì)粒 pBmE360 對其用 HindE 切 , 得到 3.9kb 片段 , 其中 | 含有多角蛋白全部序列 ( 圖 123 中為黑色框架 ), 將該片段插入 pUC9 的 HindE 位點 , 產(chǎn)生質(zhì) | 粒 p9H18 。將 p9H18 用 EcoR I 切后于 50U BAL31 外切核酸酶緩沖液中 23 水浴 10min, 更 | 掐鍾油油菲如 n 入 07

6、倍他烈的。氣 mnlAd EDTA 終止反應(yīng)。將截短的 p9H18 片段用 Hind E i切 , 并通過瓊脂糖凝膠電泳分離 2.7kb 的 Hind 皿平頭末端片段 , 將其插入 pUC9 即 p9B310的 Hind HI-Sma I 位點 O 另外 , 將 pBmE36 的 3.1 峙的 HindE 片段連接到 pUC8 上 , 得到質(zhì)粒 p8H225, 用 EcoR I 及 Aat E 切 , 得含有多角蛋白基因下游 3.1kb 基因的 3.5kb 片段 , 將其連接到 p9H18 的 4.7kb 的 EcoR IAat E 片段上 , 產(chǎn)生雜交質(zhì)粒 p89B310, 它在啟動子下游含

7、有多聚接頭 (EcoR I 、 BamH ISma I 、 Sal I 、 Pst I 位點 ) 。將從基因文庫中用 183bp 探針調(diào)出的在 ATG 后含有 Sma I 位點 ( 即有序列 CCCGGGATG) 的 IFNm J 基因片段連接到 p89B310 上 , 便構(gòu)建成質(zhì)粒 pIFN2B310 。將 pIFN2B310 與病毒基因組 DNA 便可共轉(zhuǎn)染 BM- N 細(xì)胞系或家蠶幼體 , 其具體操作如下 : 向 2.5mL 含有 0.25molACaCl2 、 10 g BmNPV DNA 及 65 g pIFN2B310 的溶液中加含 0.28II1014NaCl 、 0.7mmoi

8、/L Na2C03 、 0.7IIIII1014 Na2HP04 、 50mmol/L EfEPE (pH 7.1) 的緩沖液 , 進(jìn)行沉淀。取 0.45ml 沉淀加至 4.5mi 含 3 × 106 個細(xì)胞的培養(yǎng)液中 ,12h 后換液一次 , 再培養(yǎng) 4d, 即可得到重組病毒 BmIFN2B310 。用兩個噬菌斑單位的病毒感染 3 × 106 個 BM-N 細(xì)胞或用 50 L3 × 105 個噬菌斑單位的病毒溶液注人家蠶幼體 , 培養(yǎng) 24h 后收集培養(yǎng)液便可得到干擾素。2.IFN- 目的表達(dá)將人 IFN-R 基因 HimdE 片段插人載體 pSV2-dhfr

9、中 SV40 晚期啟動子 PL 下游的 Pvu E 位點。用此重組質(zhì)粒與帶有黃瞟嶺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (XGPRT) 基因的質(zhì)粒 pSU-gpt 共轉(zhuǎn)染次黃瞟嶺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (HGPRT) 基因缺陷小鼠的骨髓瘤 (sp24) 細(xì)胞 O 經(jīng)過霉盼酸及氨基喋嶺培養(yǎng)基篩選 , 便可得到表達(dá)人 IFN-R 。具體操作步驟如下 : 將含有人 IFN-p 基因的重組質(zhì)粒 pBV-92 用 EcoR I 及 Hind E 酶切 , 分別作為探針模板及插入片段 , 同時用 PvuII 切載體 pSVZdhfr 質(zhì)粒 , 使其線性化后將外源基因插入。將次黃瞟嶺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因缺陷的 sp2/0 細(xì)胞在含有 10

10、% 小牛血清、 10% 青鏈霉素的 DLfEM 培養(yǎng)基中傳 34 代后在小空斑瓶中培養(yǎng) 24h, 成半懸浮狀 ,400r/ 勺 1in 離心 5min 將細(xì)胞沉積加入新鮮培養(yǎng)基 , 再培養(yǎng) 24h 。轉(zhuǎn)染液中含目的基因 pSVHIF 和標(biāo)記基因 pSVZgpt( 比值為 10:1), 其中 DNA 濃度為 20 g/IIIlo 在 2IIIol/L CaCl263 陣、 10mmolATris-HCl (pH 7.1)428 L 中緩緩加入 2 × HeBs 液 (EEPES50mmol 只 L 、 NaCl280mmolA 、 Na2HP040.75mmolA 、 0.75IIlI

11、I1014 Na2HP04,pH 7.1) 約 500 L, 加入 sp2/0 細(xì)胞培養(yǎng)物中 , 輕輕搖勻 37 孵育 8h 。再更換為含有黃瞟嶺 250 g/mL 、次黃瞟嶺 15 g/mL 、胸昔 10 g/mL 、氨基蝶嶺。 -2 g/mL 、霉盼酸 25 問 /mL 的 DhEM 培養(yǎng)基 ,37 cq 孵箱中選擇性培養(yǎng)。一周后更換為含 250 g/mL 黃瞟嶺的 D; 舊 M 培養(yǎng)基 , 繼續(xù)培養(yǎng) 2 周以上 , 檢查 IFN-P 活性。3.IFN- 的表達(dá)以鼠干擾素 MuIFN- 為例 ( 圖 12-3) 。用含人 IFN- 編碼區(qū)基因的探針與噬菌體 MG9 構(gòu)建的鼠 M600 基因

12、組 DNA 文庫在 20% 甲酷膠中進(jìn)行低嚴(yán)格性的雜交 , 膜用 0.3molANaCl 、 0.03II1014 擰棱酸納及 0.1%NaEbS04 在室溫洗滌兩次。將結(jié)合的噬菌體用噬菌斑法純化 , 提取 DNA 后 , 用多種限制性內(nèi)切酶切 , 以 1% 葡聚糖凝膠電泳純化后與人 CDNA 探針雜交 , 將 MG9 中與探針可以雜交的 10.5kb 的 BamH I 片段亞克隆到 pBR322 的 BaIIIH I 位點 , 產(chǎn)生質(zhì)粒 pMG10.5 。通過電泳分出插入片段大于 6000 坤 , 即含有完整 MuIFN-Y 的質(zhì)粒 , 用 PvuII 酶切 , 六個切點中有一個位于 5&#

13、39; 端非編碼區(qū) , 取從此切點到第一內(nèi)元中 Cla I 的 348bp 的片段以及用 Cla I 及 Bgl H 酶切得的 MuIFNm 3F 端片段 O 將載體質(zhì)粒 p342E 用 EcoR I 及 BamH I 酶切 , 并用聚合酶 I 將 EcoR I 切點補成平頭末端 , 與以上制得的兩個片段混合 , 一同轉(zhuǎn)化大腸桿菌 294, 選出 AIIIP 抗性菌株 , 從中提取質(zhì)粒即為含有干擾素編碼基因的 pSVEII111 。用表面活性劑右旋糖所活化 COEL1 細(xì)胞 , 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入并培養(yǎng) 48h 后離心 , 上清液中便含有干擾素。4. 嵌合干擾素的表達(dá)嵌合干擾素大致可以分為兩種類型 :

14、 一種是兩種不同類型或同類型而不同亞型的干擾素間進(jìn)行嵌合 , 另一種是干擾素或其部分序列與其他活性物質(zhì) , 如抗體、白介素等進(jìn)行嵌合 , 以便得到新的生物活性產(chǎn)物。下面就這兩種情況分別舉例介紹。將從基因文庫中調(diào)出的編碼淋巴細(xì)胞干擾素 B 和 D 的 CDNA 連接到大腸桿菌色氨酸啟動子、操縱子、核糖體結(jié)合位點及起始密碼子 ATG 后面 , 分別構(gòu)成表達(dá)載體 pLYEN-B 和 PLy- IFN-D 。為構(gòu)建嵌合干擾素 , 可先將親代干擾素的編碼序列在相同位點 S1(Sa113A I ) 、 Pv(PVUE) 、 S2(Sa113A I ) 切斷 , 產(chǎn)生含有氨基端 160 、 192 、 61

15、92 、 93150 、 93166 、 151166 位氨基酸的片段 , 用 6% 的聚丙烯釀膠凝膠電泳分離 ( 圖 124) 。將合適的片段連接 , 得到嵌合DNA, 將含有嵌合 DNA 的質(zhì)粒用 HindE 和 Pst I 切后將酶切片段連接到 pBR322 的 HindEm pst I 位點上 , 將得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中 , 同時對 DNA 序列進(jìn)行測定。含有轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的大腸桿菌 HT-2 在 M9 培養(yǎng)基中培養(yǎng)到 OD650 為 58 時 , 離心得到細(xì)胞 , 并用含 100mmoIATris-HC1 、 0.5molANaCl 、 5mmolAEDTA 及 0.1IIIEno

16、l/L PMSF 的 pH 為 8.0 的緩沖液重新溶解之。在 0 加入 1mg/ml 溶菌酶 , 細(xì)胞在溶菌液中裂解。離心后將上清用單克隆抗體親和層析柱純化兩次 , 將純化后的活性干擾素溶于 PBS 后利用超濾膜 YM10 濃縮至 13 時 , 再將濃度調(diào)整到 0.1/IIIgmlo 利用 SDS 聚丙烯酷膠電泳對于擾素的純度進(jìn)行測定。IFN- 及 TNF-R 基因已經(jīng)分別被克隆 , 并用工程菌加以表達(dá)。對其序列的研究表明 , IFN-R 在竣基端的 13 個氨基酸以及 TNF- 下在氨基端的 23 個氨基酸均對它們的生物活性沒有影響 , 因此在設(shè)計構(gòu)建 IFN- 與 TNER 嵌合物時可以

17、將其去除 , 利用色氨酸啟動子構(gòu)建的含有 IFNE 氨基端 134 個氨基酸及 TNF-P 竣基端 148 個氨基酸的表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖 12-50此外 , 基因工程在抗體技術(shù)上的應(yīng)用使干擾素與抗體能夠有機(jī)地結(jié)合 , 通過抗體的靶向作用 , 增強干擾素的定向能力 , 提高干擾素體內(nèi)作用的效率。5. 提高干擾素產(chǎn)量的方法干擾素是一種誘生物質(zhì) , 必須在一定的誘生劑如病毒、細(xì)菌等作用不才能生成 , 所以在基因工程中 , 常常用一些強啟動子如色氨酸啟動子 , 將干擾素的表達(dá)從條件型變?yōu)榻M成型 , 以提高產(chǎn)量。酵母是一種較為常用的表達(dá)宿主 , 但其外源基因的大量表達(dá)必須在缺少元機(jī)磷的條件下才能進(jìn)行。通過

18、對其酸性磷酸酶酶的阻遏基因及溫度敏感型負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行改造 , 就可以使酵母菌在 35 的高溫下生長 , 在 25 下誘導(dǎo)表達(dá) , 并且其表達(dá)與無機(jī)磷的含量無關(guān)。實驗表明未誘導(dǎo)時產(chǎn)量為 6 × 104UA, 而誘導(dǎo)后產(chǎn)量可達(dá)到 1 × 107UA 。由于 IFN- 、自、性質(zhì)各異 , 在進(jìn)行表達(dá)時 ,IFN 干的產(chǎn)量往往遠(yuǎn)不及 IFN- 、 IFN- 日 , 因此就必須進(jìn)行表達(dá)體系的改進(jìn)。如利用含噬菌體 T5 早期啟動子及強核糖體結(jié)合位點的高效轉(zhuǎn)錄二表達(dá)體系 , 可以使 IFN- 的表達(dá)也達(dá)到 4 × 109U/L 的水平。其方法為用人工合成的 T5P25 強啟動手

19、 其中含有啟動于及核糖體結(jié)合位點 ): 取代質(zhì)粒 pJP1 在 EcoRV 與 HindE 之間的 Tef 啟動子 , 形成質(zhì)粒 pJR1R3, 將其用 HindE 線性化后插入 IFNEY 的編碼序列 , 便可以得到高效的表達(dá)質(zhì)粒 IFN -IFNY 。將 IFN 基因置于 Tetr 基因的上游 , 有利于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的篩選和保持 ( 圖 12-6)O其中合成的啟動區(qū)序列為 :ER I35 區(qū)-10 區(qū)GAAITCAAAAATrrA TTGCTT AGGAAAAATTTTI IGTATAATE 丑 nd 皿AGAI ATAAATTTGAAGCTAGGAGGTTTAAGCTT啟動子核糖體結(jié)合位點四

20、、提取、純化及鑒定對干擾素的提純可分為粗提和進(jìn)一步純化 , 以 IFN- 為例 , 粗提時將菌液 5000r/min 離心取細(xì)胞 , 加入 1/100 體積的 7mol/L 鹽酸肌冰浴 2h 裂解細(xì)胞后 17000r/min 離心 5min, 取上清液。用 510 倍體積的 0.15mol/L 棚酸鹽緩沖液稀釋后在 1OIIIII1014 的 NH4Ci 中透析 20h, 再 15000r/min 離心 10rIlino 將上清液用 80%(NH4)2S04沉淀 , 用水溶解后再透析去除 (NH4)2S04, 再用離子交換的方式分離各種蛋白 O 如果要進(jìn)一步純化 , 可用單克隆抗體進(jìn)行親和層析

21、。將 Sepharose4B 與純化的抗 IFN- 單克隆抗體混合振搖 , 室溫放置 4h 后低速離心 , 并用 0.1Enol/L= N 注 fC03(pH8.5) 的緩沖液洗去未結(jié)合的抗體 , 加入等體、積的乙醇膠并振蕩 4h 以上 , 將殘存的活性基團(tuán)加以封閉 O : 用 pH 4.0 的醋酸鹽緩沖液及 pH 8.0 的 Tris-HCl 緩沖液交 i替洗滌 3 次 , 并用 pH 7.5 的 0.1molATriSEHCi 加以平衡 1 后裝柱。用 pH 7.2 的 0.01molJL PBS 洗柱至洗脫液 OIh80 到基線 , 將含有 IFN 的混合液上樣 , 如一次吸附不完 A

22、全可用流出液再上柱一次。用 PBS 反復(fù)洗柱 , 至流出液的 1 吸收回到基線。用 pH 2.5 的 0.1molA Gly-HCl 洗脫并分 4 段收集 , 并對各部分濃度進(jìn)行測定。最后用 pH 2.5 的 0.1molA Gly-HCl 再生 , 用含 0.01% 間的 PBS 沖洗凈 ,4 保存。同時 , 利用親和層析技術(shù)還可以對只占總蛋白 0.1%1% 的干擾素進(jìn)行分離和濃縮。五、活性檢測1. 對 (3 二 5')oligo(A) 合成酶活性的誘導(dǎo)在含 1% 小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2 × 105 個 /ml Daudi 細(xì)胞 , 并分別加入 1U

23、/m1 、 10U/ml 、 100U/ml 、 1000U/ml IFN 。 24h 后 9000r/ min 離心 2min, 并將沉淀分散于 500 L 冷的含 20mmoiAEfEP- ES 、 5mmol/L MgCl2 、 I20mmol 只 L KCl 、 7mm014 二硫蘇糖醇、 10% 甘氨酸、 05%NP40(pH7.5) 的裂解液中 , 冰浴 2min 后 9OOOr/min 離心 8IIlino 取上清與 50 L poly(rI):poly(rC) 瓊脂在 30 共浴 15min, 離心去除未吸附部分 , 而將結(jié)合物與 2.5mmolA -32p-ATP 及磷酸激酶

24、在 30 水浴 20h 。將混合物上 30 L 酸性磯土柱 , 用 3mllmolA 鹽酸肌洗脫 , 將洗脫液與未用 IFN 誘導(dǎo)的對照組進(jìn)行比較便可測出 IFN 的活性。2. 抗增生活性在含 15% 小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 5 × 104 個 /ml Dauda 細(xì)胞 ,48h 后加入 IFN, 再培養(yǎng) 72h, 用 2BI 型庫爾特計數(shù)器對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù) , 即可以得到 IFN 的抗增生活性。3. 細(xì)胞病變抑制作用將在含 10% 小牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)的 WISH 細(xì)胞用 0.03%EDTA 、 0.25% 的膜蛋白酶 1mi 在室溫下消化 23mi

25、n 后 , 倒出消化液 , 用 Eagle 液分散細(xì)胞 , 然后用含 10% 小牛血清的 DMEM 液配成 5 × 105 個 /ml 的細(xì)胞懸液 , 用微量板在37 含 5%C 馬的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。用不同稀釋度的 0.1ml IFN 溶液加入各孔后再培養(yǎng) 7 h 。每孔加入 0.1ml 含 1001000TcID50 濾過性口腔炎病毒 (VSV) 進(jìn)行病毒攻擊。將病毒對照組與細(xì)胞對照組進(jìn)行比較便可以測得其抗病毒活性。六、新型干擾素1. 活性增加的干擾素通過定點突變或干擾素的嵌合可提高干擾素的活性 , 如將重組干擾素自 17 位的 Cys 改為 Ser, 可提高抗病毒活性 10 倍

26、。新型雜合的 IFN- D 對 NK 細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力比親本提高了 10400 倍 , 如將 IFN- 4 與 IFNtl 進(jìn)行嵌合 , 得到的 IFN 活性分別是親代的 4 倍及 20 倍。而用鼠 IFNt1 的 A 段與 IFN- 飩的 B 段進(jìn)行雜交 , 活性可提高 10100 倍。此外 , 如上面介紹的將 IFN 與 TNF 結(jié)合 , 可以產(chǎn)生不同的活性。2. 穩(wěn)定性增加的干擾素仍以上面提到的重組 IFN R 為例 , 親代干擾素在一 70 75d 后大多數(shù)喪失抗病毒活性 , 而突變后在同樣條件下保存 150d 仍不失活。3. 改變抗原性的干擾素如將 IFN 仇的 141 位上 Cys

27、用 Tyr 代替 , 則其抗原性發(fā)生改變 , 不與體內(nèi)自然存在的 IFN 在 1 爭奪受體 , 雖然這種抗原性改變的機(jī)率很小 , 但仍不失為一種研究方向。4. 改變種屬特異性的干擾素IFN- D 在牛細(xì)胞株中活性最高 ,IFN- A 在人細(xì)胞系中活性最高 , 而其嵌合體與兩個親本都不相同 , 在鼠細(xì)胞中的活性最高。第三節(jié)應(yīng)用一、臨床治療方面干擾素作為較早被研究的用基因工程方法合成的生物活性物質(zhì) , 雖然在基因的調(diào)取、構(gòu)建、表達(dá)方面仍有較多的工作在進(jìn)行中 , 但研究的熱點已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了臨床應(yīng)用及臨床前的動物實驗方面 , 并且在較多疾病的治療方面取得了進(jìn)展。1. 抗病毒目前的研究主要集中于抗各類肝炎病毒方面 , 在抗 HIV 、抗 HSV 等方面也有較多的研究。2. 提高免疫系統(tǒng)機(jī)能在小鼠實驗中重組 IFN- 對 NK 細(xì)胞的活性、吞噬細(xì)胞的溶解性、絲裂原誘導(dǎo)的母細(xì)胞化均有促進(jìn)作用 , 同時減少外周血及骨髓量。在牛體內(nèi)的實驗表明 , IFN- 可以增強免疫抑制動物的免疫系統(tǒng)活性。3. 抗腫瘤通過與糖基化的淋巴細(xì)胞毒素嵌合 ,IFN- 可以提高小鼠對 HT-1080 纖維肉瘤、 G,361 惡性黑色