亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T和A1298C多態(tài)與胃癌的遺傳易感性

1、亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T和A1298c多態(tài)與胃癌的遺傳易感性:單位:郵編:）作者：李松,祭美菊,侯鵬,何農(nóng)躍摘要目的：探討代謝葉酸的亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR基因單核苷酸多態(tài)與胃癌風(fēng)險的關(guān)系。方法：以聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長度多態(tài)方法分析170例胃癌病人和性別、年齡配對的140例正常對照者的MTHF型因C677有口A1298遵因型及其與胃癌風(fēng)險的相關(guān)性。結(jié)果：在正常對照中，MTHFRS因677CCCTTT基因型頻率分別為47.9%、40%和12.1%，而在胃癌病人中分別為35.9%、45.9%和18.2%。在病例組中677（CT+TT茂異型基因者占64.1%,顯著高于對照組中

2、的52.1%,差異具有顯著意義（乂2=4.54,P<0.05）。與677CC8因型者相比,變異型基因者和TT型基因者發(fā)生胃癌的危險性分別高1.67倍（。助1.67,95%CI為1.062.64）和2.67倍（。助2.67,95%CI為1.3825.341）。A1298c基因型在病例和對照中的分布差異無顯著性意義。但進一步分析發(fā)現(xiàn)，1298變異基因型與677變異基因型之間有協(xié)同作用。攜帶MTHFR677TT/1298A夔因型個體發(fā)生胃癌的風(fēng)險是攜帶MTHFR677CC/1298AAs因型個體的3.684倍（95%CI為0.82925.776)。結(jié)論：MTHFR單核甘酸多態(tài)是胃癌的遺傳易感性

3、因素。關(guān)鍵詞胃癌；單核苷酸多態(tài)性；亞甲基四氫葉酸還原酶基因；疾病易感性DNA甲基化是基因表達，DNA的穩(wěn)定性、完整性和誘變的重要決定因素，染色體和DNA甲基化異常都是可遺傳的，是導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性而引發(fā)腫瘤的重要機制1。相關(guān)研究表明，細胞內(nèi)低甲基化是胃癌形成的一個重要原因，亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10methylenetetrahydrofolatereductase,MTHFR)!因多態(tài)會影響葉酸在體內(nèi)的正常代謝，造成甲基不足，從而促進胃癌的產(chǎn)生，國內(nèi)外刊物報道了此方面進行的一些研究。MTHF基因在總的人群中呈高度多態(tài)性，在其編碼區(qū)有2個常見的單核苷酸多態(tài),即C677T和A1298C，前者

4、位于催化區(qū)而后者位于活性調(diào)節(jié)區(qū)2。作者對江蘇南京地區(qū)的170例胃癌病人和140例相匹配的正常對照者進行研究，分析MTHFRI因C677T和A1298c多態(tài)性與胃癌發(fā)生的風(fēng)險性的關(guān)系。1材料和方法1.1 實驗材料1.1.1 標(biāo)本來源標(biāo)本取自170例胃癌病人和140例正常對照者。病人分別來自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院、南京市鼓樓醫(yī)院和江蘇省人民醫(yī)院，樣品為腫瘤組織和外周血；年齡、性別相匹配的正常對照者來自東南大學(xué)校醫(yī)院和東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，所取樣品均為健康人的外周血。所有的病例和正常對照者均為江蘇省南京市及其周邊區(qū)域居住的漢族居民。病例組中男、女性分別為118例和52例，平均年齡為(52.05

5、7;10.67)歲；對照組男、女性分別為82例和58例，平均年齡為(50.87±7.69)歲。胃癌組和對照組性別、年齡分布差異無顯著意義(P值分別為0.129和0.28),基因組DNA勺提取采用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚/氯仿法。1.1.2 主要試劑蛋白酶K、EDTA、TrisCl和飽和酚均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶HinfI(10U“-1)和MboII(10Uwl-1)為大連寶生物公司產(chǎn)品，所有的引物由上海博亞生物工程公司合成。1.1.3 儀器PTC225熱循環(huán)儀(MJResearch,Watertown,MA),紫外分光光度計(島津公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Syngene，

6、GeneGenius)。1.2 實驗方法1.2.1 MTHFR基因型分析MTHFR1因分型按我們已報道的方法3進行。擴增含C677TDN特段的PC對物序列為：F,5'TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA3口R,5'AGGACGGTGCGGTGAGAG'TG3擴增產(chǎn)物長度為198bp。擴增含A1298CDN站段的PCFSI物序列為：F,5'CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAICR,5'CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG3擴增產(chǎn)物長度為163bp。30膜反應(yīng)體系包括：200區(qū)gml-1DNA模板1屋，雙側(cè)引物各1”,10X

7、緩沖液3”,25mmolL-1的Mg2+2"，10mmolL-1的dNTP0.6l,1.25U的TaqDNA!合酶(5U”-1)。反應(yīng)條件：94c預(yù)變性5min,94c30s,62c30s,72c30s,35個循環(huán)，72c延伸7min；C677T基因型和A1298c基因型可以分別由限制性核酸內(nèi)切酶HinfI或MboII鑒別，677CfT突變后可被HinfI識別。純合變異基因型的PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后產(chǎn)生175bp和23bp兩個片段，雜合子產(chǎn)生198、175和23bp3個片段，而野生型基因型只有198bp1個片段。含1298AA的PCRJT物有4個MboII酶切位點，產(chǎn)生56、31、30、

8、28和18bp5個片段；AC突變后失去1個酶切位點，因此，純合突變型產(chǎn)生84、31、30和18bp4個片段，雜合子則含84、56、31、30、28和18bp6個片段（圖1）。取適量PCR產(chǎn)物分別與足量的限制性內(nèi)切酶于37c溫育過夜，酶切產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色。M1.100bp梯度DN粉子質(zhì)量標(biāo)志；M2.DL2000型DN砌子質(zhì)量標(biāo)志；1、4.AC基因型；2、3、5.AA基因型；6.CC基因型圖1MTHFRS因A1298c多態(tài)擴增產(chǎn)物RFLP圖譜1.2.2 數(shù)據(jù)處理在分型結(jié)果的統(tǒng)計分析中，病例組和對照組MTHFR基因型的頻率差異以X2檢驗確定，P<0.05為差異有顯著意

9、義。以比值比（oddsratio，OR）以及95可信度（95%onfidenceinterval,95%CI）表示各種基因型與胃癌風(fēng)險的相關(guān)性。OR值以非條件的Logistic回歸模型計算，并經(jīng)過年齡、性別等混雜因子校正。所有統(tǒng)計分析均用StatisticalAnalysisSystem軟件（6.1版，SAS公司）計算。2 結(jié)果表1為胃癌與健康對照者的MTHF型因多態(tài)性分布及其與胃癌的風(fēng)險關(guān)系。對表1中胃癌組和對照組的MTHFRI因C677T和A1298c的基因型頻率進行了遺傳平衡檢測，均符合HardyWeinberg平衡比例(均P>0.05),樣本具有群體代表性。表1MTHFR

10、4;因型頻率在病例組和對照組中的分布及其與胃癌風(fēng)險的關(guān)系注：ORS過性別和年齡校對從表1中可以看到在140例正常對照組中，MTHFRS因677CCCT和TT基因型頻率分別為47.9%、40.0%和12.1%。而在胃癌患者中這3種基因型頻率分別為35.9%、45.9%和18.2%。比較病例組中變異基因型擁有者(CT+TT占64.1%,顯著高于又t照組中的52.1%,差異具有顯著意義(x2=4.54,P<0.05)。與MTHFRS因677CC基因型者相比，變異型基因者發(fā)生胃癌的危險性為1.67倍(OR為1.67,95%CI為1.062.64)?？梢酝茢郙THF塞因C677T多態(tài)是胃癌的危險因

11、素。以胃癌677CCK因型的O朗1.00,CT8因型的O時1.60(95%CI為0.9282.639),CT基因型的危險性是CC的1.60倍，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異沒有顯著性意義(x2=2.92,P>0.05)。TT基因型的OR為2.67(95%CI為1.3825.341),TT基因型的危險性是CC的2.67倍，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異有顯著性意義(x2=4.01,P<0.05)。OR值的上升趨勢明顯，這提示MTHFRI因C677T的多態(tài)與胃癌風(fēng)險呈等位基因計量效應(yīng)關(guān)系。對照組中MTHF第1298位基因型的頻率為AA69.2%AC29.3麻口CC1.4%病傷J組1298AAAC和CC基因型頻率分

12、別是74.1%24.7附口1.2%。1298CC®因型頻率在病例組和對照組中都很低，分別只有1.2嘛口1.4%,與1298AA基因型比較對胃癌風(fēng)險沒有明顯的影響(OR為1.61,95%CI為0.3091.834)。兩組的MTHFRS因1298AC基因型頻率差異也無顯著意義。因此，可以推斷MTHFRK因A1298c多態(tài)不是胃癌發(fā)生的危險因素。我們進一步分析發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因677和1298多態(tài)可能存在著聯(lián)合作用。例如，攜帶677TT/1298AA基因型個體的OR為2.035(95%CI為0.9574.425),而攜帶677TT/1298AC基因型個體的OR增高到3.684(95%CI

13、為0.82925.776)。我們還發(fā)現(xiàn)在這些研究對象中，677TT/1298Ac或677CT/1298c嚷異基因型非常罕見，更沒有人攜帶677TT/1298CC基因型(表2)，可能兩位點均為突變型時可能有致死作用。這一結(jié)論與Song等4研究結(jié)果相一致。表2MTHFRK因677和1298基因型聯(lián)合與胃癌風(fēng)險的關(guān)系3 討論MTHFRI因6778T和1298QC突變使控制葉酸代謝的MTHFR!性顯著下降，研究表明，MTHF基因變異型純合子與血漿中同型半胱氨酸水平的升高和5甲基四氫葉酸水平的降低有關(guān)5。體外實驗也證實,MTHFR變異型純合子的DNA接受甲基能力顯著高于野生型純合子6。說明MTHFRI因

14、變異導(dǎo)致了作為甲基供體的蛋氨酸合成障礙，進而導(dǎo)致了DNA勺低甲基化。細胞基因組DNA勺去甲基化可能與細胞的過度增殖有關(guān)，研究證明細胞DNA勺甲基化水平，特別是有關(guān)基因表達控制點的甲基化水平對基因表達起調(diào)節(jié)作用，甲基化水平降低，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平就增高。提示MTHFRI因多態(tài)性可能與癌癥的發(fā)生有關(guān)。本實驗中我們研究了在葉酸代謝中起關(guān)鍵作用的MTHFRS因C677T和A1298c多態(tài)與胃癌遺傳易感性的關(guān)系，結(jié)果表明MTHF誕因單核甘酸多態(tài)是胃癌的遺傳易感因素。特別是C677T多態(tài)，擁有變異型基因的人數(shù)在病例組中的比例顯著高于對照組，其變異型基因顯著增加了發(fā)生胃癌的危險性。A1298C多態(tài)雖然其基因

15、型頻率與胃癌的發(fā)生沒有顯著意義，但其多態(tài)與MTHFR67多態(tài)可能存在聯(lián)合作用。這一結(jié)果不僅表明MTHF匪因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生有關(guān)，同時也提示胃癌的發(fā)生可能與DNA勺低甲基化有關(guān)。本研究證明MTHFRS因單核苷酸多態(tài)與胃癌風(fēng)險增高顯著相關(guān)，為葉酸攝入低和（或）葉酸代謝障礙可能在胃癌變中起重要作用的假說提供了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。為了證實MTHFRI因多態(tài)在胃癌病因?qū)W中的彳用，有必要進一步研究MTHFRI因多態(tài)與葉酸攝入量之間的基因營養(yǎng)素交互作用以及其他因素如飲酒、吸煙的影響，同時還要對MTHFRI因多態(tài)與不同部位胃癌的遺傳易感性進行研究。這需要在完善病例和對照資料，擴大樣本數(shù)量的基礎(chǔ)上進行。進一步進行這方

16、面的研究對于經(jīng)濟有效地開展胃癌的預(yù)防工作具有重要意義。參考文獻1HOLLIDAYR,GRIGGGW.DNAmethylationandmutationJ.MutationResearch,1993,285:6167.2vanderPUTNM,GABREELSF,STEVENSEM,etal.Asecondcommonmutationinthemethylenetetrahydrofolatereductasegene:anadditionalriskfactorforneuraltubedefectsJ.AmJHumGenet,1998,62:10441051.3FROSSTP,BLOMHJ,

17、MILOSR,etal.Acandidategeneticriskacommonmutationinfactorforvasculardisease:methylenetetrahydrofolatereductaseJ.NatGenet,1995,10:111113.4SONGC,XINGD,TANW,etal.MethylenetetrahydrofolatereductasepolymorphismsincreaseriskofesophagealsquamouscellcarcinomainaChinesepopulationJ.CancerRes,2001,61:32723275.5GEBHARDTGS,SCHOLTZCL,HILLERMANNR,etal.Combinedheterozygosityformethylenetetrahydrofolatereductase(MTHFR)mutationsC677TandA1298CisassociatedwithabruptioplacentaebutnotwithintrauterinegrowthrestrictionJ.EurJObstetGynecolRepr