循環(huán)腫瘤細胞的研究進展

1、循環(huán)腫瘤細胞的研究進展         【摘要】  腫瘤細胞的脫落、侵襲并進入血液循環(huán)是實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，并為最終形成臨床轉(zhuǎn)移灶提供了可能。深入研究循環(huán)腫瘤細胞有助于對腫瘤轉(zhuǎn)移機制的了解，可為抗轉(zhuǎn)移治療提供依據(jù)。全文綜述循環(huán)腫瘤細胞的臨床意義及檢測方法。 【關鍵詞】  血液循環(huán)腫瘤循環(huán)細胞腫瘤轉(zhuǎn)移（The Fourth Hospital, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China）Abstract: Cancer cell e

2、xfoliation, invasion and entry into circulation system is the early event with metastasis, which provide the possibility to formation of clinical metastase. Further research about the circulating cancer cells can help us to understand the mechanism of metastasis and offer the scientific proof agains

3、t anti?鄄metastasis. The clinical significance and detection of circulating tumor cells were reviewed.   Key words: blood circulation; neoplasm circulating cells; neoplasms metastasis早在1896年，Ashworth曾報道1例因癌癥死亡的患者外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤的細胞，并首次提出循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell, CTC）的概念1。隨著人們對腫瘤轉(zhuǎn)移機制研究的深入，尤其

4、是伴隨現(xiàn)代檢測技術(shù)的廣泛應用，CTC逐漸被人們所重視。本文就其研究進展作一綜述。   1概述   CTC指自發(fā)或因診療操作進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。隨著腫瘤細胞的不斷增殖,部分細胞可以通過分泌一種抑制黏附因子表達的物質(zhì),增加其運動能力并使之與腫瘤母體脫離。這些脫落的腫瘤細胞再分泌一種蛋白溶解酶，以破壞周邊宿主結(jié)締組織并進入脈管系統(tǒng)。診療操作也可使腫瘤細胞擴散進入外周血循環(huán)。Louha等報道，在肝癌患者手術(shù)中牽動肝臟易發(fā)生醫(yī)源性腫瘤細胞擴散，其原因可能是肝臟具有海綿狀結(jié)構(gòu)，牽動肝臟可使器官伸展和壓縮。   進入循環(huán)的腫瘤細胞絕大多數(shù)在短

5、期內(nèi)死亡。宿主的免疫識別和機械殺傷作用以及腫瘤細胞自身因素，如缺乏變形性以致不能順利通過循環(huán)管道系統(tǒng)，或缺乏形成癌栓能力等均可導致腫瘤細胞死亡。只有極少數(shù)具有高度活力、高度轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來，相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶。因此，在外周血中檢測到腫瘤細胞預示著有可能發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移。   2臨床意義   2.1CTC與腫瘤轉(zhuǎn)移   研究認為，自發(fā)和（或）由外科操作進入血循環(huán)的腫瘤細胞可以單個或簇狀種植和貼附在其它組織，以休眠狀態(tài)蜇伏其中，等待某一激活劑喚醒，一旦獲得活力或在其它因素的影響下，它們便開始

6、增殖，通常會遷移到更適于增殖的新的器官3,4。因此推測，臨床觀察到的經(jīng)成功切除原發(fā)灶一段時間后患者發(fā)生其它器官轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，如肝移植治療肝癌后在移植肝或自體肺中復發(fā)；眼黑色素瘤切除后患者可在術(shù)后年發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，可能由CTC引發(fā)。Luzzi等應用小鼠體內(nèi)模型研究黑色素瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛能，證明滲出的處于休眠狀態(tài)的腫瘤細胞與形成早期微轉(zhuǎn)移之間的比率很高。休眠細胞增殖和凋亡率很低，僅23。休眠細胞如何保持休眠狀態(tài)并在一段時間后產(chǎn)生惡性效應的確切機制目前尚不清楚。普遍認為腫瘤細胞長期保持休眠狀態(tài)主要依賴于腫瘤血管形成缺如和機體正常的免疫功能狀態(tài)。研究提示，未能形成轉(zhuǎn)移的另一關鍵因素是休眠細胞未能得到適宜的激發(fā)

7、；細胞因子、生長因子、激素和細胞外基質(zhì)等微環(huán)境因素均參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞休眠后的增殖。   2.2CTC與臨床分期   是否存在遠處轉(zhuǎn)移是臨床分期的判斷標準之一，雖然血液中檢測到腫瘤細胞并不意味著必定形成轉(zhuǎn)移灶，但是研究表明，CTC的存在與腫瘤分期具有明顯的相關性。Kim等研究可手術(shù)的和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周血中的癌細胞，發(fā)現(xiàn)CTC在早期能手術(shù)的乳腺癌患者中是罕見的，但在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者中很多。高紀東等應用流式細胞儀定量檢測乳腺癌患者手術(shù)前后CTC數(shù)量，結(jié)果顯示其與病理分期及脈管瘤栓均有明顯的相關性。分子生物學技術(shù)的發(fā)展，使通過檢測實體瘤患者外周血腫瘤相關基

8、因，借以分析CTC的存在成為可能。Kurusu等通過檢測103例非小細胞肺癌患者外周血中的腫瘤組織特異性CEAmRNA，發(fā)現(xiàn)陽性率很大程度上與術(shù)前術(shù)后的疾病分期有關。李地芬等研究結(jié)果顯示隨著腫瘤分期的增高，結(jié)直腸癌患者外周血中的CEAmRNA檢出率亦增高。Zsolt等檢測前列腺癌患者血液中PSAmRNA及PSMAmRNA的表達，發(fā)現(xiàn)陽性率亦隨腫瘤分期的增高而增加。目前尚未證實CTC水平可被用作判斷分期的標準檢測，然而它確能有助于改善腫瘤分期，從而提高臨床醫(yī)生的警惕性，以便采取更加積極的治療。   2.3CTC與個體化治療   當前對惡性腫瘤的治療是基于腫

9、瘤大小、病理分級、淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移、病人一般狀況及腫瘤發(fā)展趨勢等因素之上的綜合治療。但遵循統(tǒng)一的診斷標準建立的治療方案缺乏個體化。隨著對CTC研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)檢測CTC有助于建立個體化的治療方案。Beitsch等10采用流式細胞計數(shù)、免疫化學等方法比較早期及晚期乳腺癌患者CTC的水平，明確發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌比早期乳腺癌有   3.1免疫細胞化學（immunocytochemistry, ICC）   這一檢測方法基于抗原抗體結(jié)合反應的原理，利用單克隆抗體（McAb）與特異的腫瘤標記物結(jié)合，并通過酶與底物反應顯色來判斷腫瘤細胞的存在。檢測的腫瘤標志物主要

10、分三類：上皮細胞角蛋白（CK），如CK?鄄19；上皮細胞膜特異性抗原，如黏蛋白類，包括EMA、HMFG、HEA?鄄125等；腫瘤相關糖蛋白（TAG），如TAG?鄄12。1980年，Sloane等18首次采用ICC的方法檢測乳腺癌患者骨髓中的腫瘤細胞。該方法可以進行形態(tài)學分析，但是檢測的細胞量少，敏感性只有104105（即在1萬10萬個單核細胞中發(fā)現(xiàn)一個腫瘤細胞），而且許多分化差的腫瘤不能表達目標抗原，而非上皮細胞中細胞角蛋白和上皮細胞抗原亦可能陽性,故特異性不高。Braun等19認為由于CTC不表達白細胞共同抗原CD45，采用CD45/CK雙標技術(shù)可以提高ICC檢測的特異性。 

11、60; 3.2多聚酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）   該方法的原理是特異性擴增出腫瘤細胞中因癌基因、抑癌基因突變或染色體重排而產(chǎn)生的DNA異常。這類基因的改變應滿足以下條件：該基因的突變在待檢腫瘤中發(fā)生率較高，至少應達50左右；基因內(nèi)發(fā)生堿基突變的部位應相對集中，如果過分分散，目前臨床應用有困難。這一方法檢測腫瘤細胞的敏感性約1×106左右，比Southern印跡雜交法約提高10 000倍。應用PCR技術(shù)檢測CTC受到缺乏腫瘤特異性和高表達標記的限制，該方法敏感度高，易出現(xiàn)假陽性，同時由于癌細胞的異質(zhì)性亦可出現(xiàn)假陰性。目前多

12、應用突變等位基因擴增（mutant?鄄allelie specific amplification, MASA）的PCR技術(shù)，檢測大腸癌和胰腺癌患者外周血中具有K?鄄ras癌基因突變的腫瘤細胞。   3.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT?鄄PCR）   這種方法在PCR的基礎上擴增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉(zhuǎn)錄的DNA片斷。RNA檢測的特異性靶mRNA有：某些基因改變后RNA水平的異常，如點突變（p53、ras）、缺失（BRCA1、BRCA2）、異構(gòu)（CD44）、擴增（erb?鄄B2、EGFR）；組織特異性標志mRNA,如mucin、cytokeratin、E

13、R、maspin；腫瘤特異性標志mRNA，如CEA、?鄄HCG等20。1991年Smith等21首先將RT?鄄PCR應用于外周血黑色素瘤細胞的檢測。此后，這一技術(shù)已分別在多種惡性實體瘤中得以應用，如對消化系統(tǒng)腫瘤作CEAmRNA檢測22，對乳腺癌作MAMmRNA檢測23，對肝癌作AFPmRNA檢測24，對前列腺癌作PSAmRNA檢測25等。RT?鄄PCR方法具有高度的敏感性和特異性，其敏感性可達106107，特異性在于其擴增模板為mRNA：RNA在細胞外環(huán)境中極不穩(wěn)定，一旦檢測到特異性mRNA的表達就意味著有腫瘤細胞的存在；mRNA的表達不受相應編碼蛋白表達高低的影響；引物的設計可以跨越兩個不

14、同的外顯子，避免了整個基因組的擴增，有利于消除假陽性結(jié)果。由于RNA易被RNA酶降解，同時該方法具有PCR技術(shù)的局限性，仍可出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。為提高RT?鄄PCR的特異性和敏感性，新的方法不斷產(chǎn)生，在RT?鄄PCR的基礎上又增加了定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應（QPCR）,熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應（FQ?鄄PCR）等。            3.4流式細胞術(shù)（flow cytometry, FCM）   該技術(shù)是以流式細胞儀為工具對懸液中的細胞進行測量分析，具有快速、準確的優(yōu)

15、點，其篩選細胞的速度為103104個細胞/s。應用FCM從血液中檢測上皮性腫瘤細胞其價值很大程度上依賴于可分析的細胞數(shù)量26。盡管FCM不能提供有關細胞形態(tài)方面的信息，但是,其在鑒定、計數(shù)腫瘤細胞方面比RT?鄄PCR更可靠。Irene等27研究證明FCM可作為一種檢測CTC數(shù)量的有力工具?，F(xiàn)有的FCM需取大約50ml外周血方可檢測腫瘤細胞負荷，若檢測前進行特異性富集腫瘤細胞，將在很大程度上提高檢測的敏感性。   3.5其它   目前，CTC檢測方法較多，但檢出率仍有限，一些明確存在轉(zhuǎn)移灶的患者CTC陽性率可能很低。導致這一情況的原因可能是不了解腫瘤細胞釋

16、放的規(guī)律（CTC的釋放可能是間歇性的），且循環(huán)中的腫瘤細胞常常成群，單點時間的檢測可產(chǎn)生一定的偏倚，而實際表達可能更高。連續(xù)多次取樣或加大樣本量可能會提高檢出率。再者，檢測方法本身也都存在一定的局限性，可能出現(xiàn)假陽性與假陰性。在設立對照，均衡、優(yōu)化實驗條件的同時，可選用免疫磁性分離技術(shù)即磁性激活的細胞篩選（magnetic?鄄activated cell separation，MACS）富集腫瘤細胞、激光掃描細胞計數(shù)器等來提高檢測的敏感性和特異性。Vona等28根據(jù)上皮腫瘤細胞的大小建立了一種簡便、經(jīng)濟的分離計數(shù)CTC的方法，即利用上皮腫瘤細胞比外周血細胞大的特點，通過過濾使之得到分離、富集。

17、該方法敏感度高，1ml血中有1個腫瘤細胞也可檢出，適用于多種類型的腫瘤。已有研究表明，在肝癌患者外周血腫瘤細胞的收集方面，該方法的敏感性比RT?鄄PCR方法更高，若與其它方法聯(lián)合應用可顯著提高檢測效率和準確性。   4 結(jié)語   通過分析CTC的生物學特征，有助于提高人們對腫瘤轉(zhuǎn)移規(guī)律的認識。研究表明，CTC的出現(xiàn)可作為一個獨立的預后因素，并與無復發(fā)生存有關。早期準確地檢測CTC對合理地進行綜合治療至關重要，并可作為腫瘤療效評估指標及加強輔助化療的選擇性指標，有助于建立個體化治療方案，從而降低腫瘤復發(fā)率，延長患者生存期，使腫瘤的綜合治療更加及時、完善、有

18、效。   隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展，CTC檢測方法的敏感性和特異性將不斷提高，特別是與細胞富集技術(shù)的結(jié)合更有助于早期CTC的發(fā)現(xiàn)。目前在單個CTC水平進行基因組及mRNA表達譜的分析，將有助于提高人們對CTC本質(zhì)的認識，還可通過體外培養(yǎng)CTC進行基礎研究，以期為腫瘤治療提供新的理論依據(jù)?？傊?，檢測CTC有著良好的應用前景，隨著這一研究領域的不斷發(fā)展，必將產(chǎn)生新的診療手段，從而使腫瘤的治療提高到一個嶄新的階段。【參考文獻】  Ghossein RA, Carusone L, Bhattacharya S. Review:polymerase chain reac

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