第四章動物細(xì)胞工程制藥

1、L o g o動物細(xì)胞工程制藥動物細(xì)胞工程制藥第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞學(xué)說的創(chuàng)立細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和細(xì)胞學(xué)說的創(chuàng)立v1665年年 Robert Hook 發(fā)現(xiàn)軟木塞中蜂窩發(fā)現(xiàn)軟木塞中蜂窩狀小室狀小室（cell）v1667年荷蘭科學(xué)家年荷蘭科學(xué)家 Leeuwenhoek 觀察到觀察到真正的活細(xì)胞真正的活細(xì)胞v18381839年年 德國植物學(xué)家德國植物學(xué)家 Schleiden 和動物學(xué)家和動物學(xué)家 Schwann 提出提出細(xì)胞學(xué)說細(xì)胞學(xué)說“細(xì)胞學(xué)說”的基本內(nèi)容v有機(jī)體是有機(jī)體是由細(xì)胞和細(xì)胞的產(chǎn)物所構(gòu)成的，細(xì)胞是由細(xì)胞和細(xì)胞的產(chǎn)物所構(gòu)成的，細(xì)胞是構(gòu)成有機(jī)體的基本單位。構(gòu)成有機(jī)體的基本單位。v

2、每個細(xì)胞作為一個相對獨立的單位，既有它每個細(xì)胞作為一個相對獨立的單位，既有它“自自己的己的”生命生命, ,又對與其它細(xì)胞共同組成的整體的生又對與其它細(xì)胞共同組成的整體的生命有所助益。命有所助益。 v新的細(xì)胞可以通過老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生。新的細(xì)胞可以通過老的細(xì)胞繁殖產(chǎn)生。組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)是將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，是將組織或細(xì)胞從機(jī)體取出，在體外模擬機(jī)體體內(nèi)生理條件進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存在體外模擬機(jī)體體內(nèi)生理條件進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存和生長。和生長。細(xì)胞工程細(xì)胞工程是以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用生是以細(xì)胞為單位，按人們的意志，應(yīng)用生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行精物學(xué)、分子

3、生物學(xué)等理論和技術(shù)，有目的地進(jìn)行精心設(shè)計，精心操作，使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改心設(shè)計，精心操作，使細(xì)胞的某些遺傳特性發(fā)生改變，從而達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使變，從而達(dá)到改良或產(chǎn)生新品種的目的，以及使細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從細(xì)胞增加或重新獲得產(chǎn)生某種特定產(chǎn)物的能力，從而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出而在離體條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)、增殖，并提取出對人類有用的產(chǎn)品。對人類有用的產(chǎn)品。細(xì)胞工程包括：細(xì)胞工程包括：1. 真核細(xì)胞的基因重組、導(dǎo)入、擴(kuò)增和表達(dá)的理論和技術(shù)；真核細(xì)胞的基因重組、導(dǎo)入、擴(kuò)增和表達(dá)的理論和技術(shù)；2. 細(xì)胞融合的理論和技術(shù)；細(xì)胞融合的理論和技術(shù)；3

4、. 細(xì)胞器特別是細(xì)胞核移植的理論和技術(shù)；細(xì)胞器特別是細(xì)胞核移植的理論和技術(shù)；4. 染色體改造的理論和技術(shù)；染色體改造的理論和技術(shù)；5. 轉(zhuǎn)基因動、植物的理論和技術(shù)；轉(zhuǎn)基因動、植物的理論和技術(shù)；6. 細(xì)胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)；細(xì)胞大量培養(yǎng)的理論和技術(shù)；7. 將有關(guān)產(chǎn)物提取純化的理論和技術(shù)。將有關(guān)產(chǎn)物提取純化的理論和技術(shù)。表表1 動物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物動物細(xì)胞培養(yǎng)的產(chǎn)物 疫苗疫苗人人小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、風(fēng)疹疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫小兒麻痹癥疫苗、狂犬疫苗、風(fēng)疹疫苗、腦炎疫苗、皰疹疫苗等苗等動物動物牛病毒性腹瀉疫苗、牛痢疾疫苗、犬傳染性肝炎疫苗、豬霍牛病毒性腹瀉疫苗、牛痢疾疫苗、犬傳染性肝炎疫苗、豬

5、霍亂疫苗、狂犬疫苗、草魚出血熱疫苗亂疫苗、狂犬疫苗、草魚出血熱疫苗單克隆抗體單克隆抗體IgG、IgM、IgA等等免疫調(diào)節(jié)劑免疫調(diào)節(jié)劑-細(xì)胞生長因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、血清胸腺因子、細(xì)胞生長因子、干擾素、白細(xì)胞活化因子、血清胸腺因子、白細(xì)胞介素、胸腺素等白細(xì)胞介素、胸腺素等酶酶尿激酶、天門冬氨酰胺酶、膠原酶、細(xì)胞色素尿激酶、天門冬氨酰胺酶、膠原酶、細(xì)胞色素P450、纖維蛋纖維蛋白溶酶原激活劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶等白溶酶原激活劑、胃蛋白酶、胰蛋白酶等激素激素絨膜促性腺激素、促紅細(xì)胞生成素、促濾泡激素、生長激素、絨膜促性腺激素、促紅細(xì)胞生成素、促濾泡激素、生長激素、促間質(zhì)細(xì)胞激素、促黃體激素等

6、促間質(zhì)細(xì)胞激素、促黃體激素等第二節(jié)第二節(jié) 動物細(xì)胞的形態(tài)和生理特征動物細(xì)胞的形態(tài)和生理特征 一、動物細(xì)胞的形態(tài)一、動物細(xì)胞的形態(tài)1、動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核2、離體培養(yǎng)的細(xì)胞生長特性、離體培養(yǎng)的細(xì)胞生長特性v貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞如成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞v懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞如血液白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等如血液白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等v兼性貼壁細(xì)胞兼性貼壁細(xì)胞 如中國倉鼠卵巢細(xì)胞如中國倉鼠卵巢細(xì)胞二、動物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝二、動物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝1、動物細(xì)胞的化學(xué)組成、動物細(xì)胞的化學(xué)組成細(xì)胞中具有細(xì)胞中具有24種元素：種元素：

7、對生命起著特別重要的作用對生命起著特別重要的作用C、H、O、N、P、S 細(xì)胞中少，但是必需的細(xì)胞中少，但是必需的Ca、K、Na、Cl、Mg、Fe 其它其它Mn、I、Mo、Co、Zn、Se、Cu、Cr、Sn、V、Si、F微量元素微量元素細(xì)胞中的化合物分為：細(xì)胞中的化合物分為：無機(jī)物：如水、無機(jī)鹽無機(jī)物：如水、無機(jī)鹽有機(jī)物：如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類有機(jī)物：如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類三個階段三個階段（書（書P83頁圖）頁圖）v 第一階段：第一階段：大分子降解為小分子。多糖大分子降解為小分子。多糖單糖；單糖；脂肪脂肪甘油、脂肪酸；蛋白質(zhì)甘油、脂肪酸；蛋白質(zhì)氨基酸氨基酸v 第二階段：第二階段：小分子代

8、謝產(chǎn)生乙酰輔酶小分子代謝產(chǎn)生乙酰輔酶A、酮戊二酮戊二酸、草酰乙酸酸、草酰乙酸v 第三階段：第三階段：三個中間產(chǎn)物進(jìn)入三個中間產(chǎn)物進(jìn)入“三羧酸循環(huán)三羧酸循環(huán)”，產(chǎn)，產(chǎn)生生命活動必需的能量生生命活動必需的能量2、動物細(xì)胞的代謝、動物細(xì)胞的代謝1、細(xì)胞的分裂周期長、細(xì)胞的分裂周期長G1期：期：合成合成DNA聚合酶和聚合酶和RNA，為為DNA合成做準(zhǔn)備。合成做準(zhǔn)備。S期：期：DNA合成合成G2期：期：DNA量加倍，量加倍，RNA合成，合成，染色體螺旋化。染色體螺旋化。M期：期：0.5-1 h，分裂形成子細(xì)胞。，分裂形成子細(xì)胞。細(xì)胞分裂周期圖細(xì)胞分裂周期圖三、動物細(xì)胞的生理特點三、動物細(xì)胞的生理特點2、

9、細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象。、細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象。 接觸抑制：接觸抑制：當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時，當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時，即每個細(xì)胞與周圍細(xì)胞互相接觸時，細(xì)胞就停止增殖。即每個細(xì)胞與周圍細(xì)胞互相接觸時，細(xì)胞就停止增殖。若細(xì)胞轉(zhuǎn)化成異倍體后，該抑制可解除若細(xì)胞轉(zhuǎn)化成異倍體后，該抑制可解除腫瘤細(xì)胞在生長過程中喪失接觸抑制細(xì)胞細(xì)胞懸浮懸浮液液1010代代細(xì)胞細(xì)胞5050代代細(xì)胞細(xì)胞無限無限傳代傳代原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)有限細(xì)胞系有限細(xì)胞系無限細(xì)胞系無限細(xì)胞系多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長和分裂。生長和分裂。遺傳

10、物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)改變3、正常二倍體細(xì)胞的壽命是有限的、正常二倍體細(xì)胞的壽命是有限的 。 4 4、動物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感、動物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感物理化學(xué)因素，如物理化學(xué)因素，如滲透壓、酸度、離子濃度、剪切力、微量滲透壓、酸度、離子濃度、剪切力、微量元素等元素等的變化都會影響其生長，這是由于動物細(xì)胞沒有的變化都會影響其生長，這是由于動物細(xì)胞沒有細(xì)胞細(xì)胞壁壁的保護(hù)，所以更敏感。的保護(hù)，所以更敏感。5 5、動物細(xì)胞對培養(yǎng)基要求很高、動物細(xì)胞對培養(yǎng)基要求很高 原核生物：原核生物：只要有碳源、氮源和無機(jī)鹽就可以生長只要有碳源、氮源和無機(jī)鹽就可以生長動物細(xì)胞：動物細(xì)胞：12 種必需氨基酸、種必需氨基

11、酸、8 種以上維生素、多種無機(jī)種以上維生素、多種無機(jī)鹽和微量元素、葡萄糖、多種細(xì)胞生長因子和貼壁因子。鹽和微量元素、葡萄糖、多種細(xì)胞生長因子和貼壁因子。6 6、動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同、動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同 原核生物原核生物動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成游離的核糖體：游離的核糖體：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體：糖基化及：糖基化及一系列翻譯后修飾一系列翻譯后修飾無粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，因此沒有糖基化無粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，因此沒有糖基化及一系列翻譯后修飾。及一系列翻譯后修飾。 四、每代貼附生長細(xì)胞的生長過程四、每代貼附生長細(xì)胞的生長過程v 游離期

12、游離期v 貼壁期貼壁期v 潛伏期潛伏期v 對數(shù)生長期對數(shù)生長期v 停止期（平臺期）停止期（平臺期）游離期：游離期： 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也稱懸浮期。細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也稱懸浮期。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。此時細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。貼壁期：貼壁期： 細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘分鐘4小時貼壁。小時貼壁。 底物：底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等 進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)生長基質(zhì)潛伏期潛伏期 此時細(xì)胞有生長此時細(xì)胞有生長活動，而無細(xì)胞分裂?；顒?，而無細(xì)胞分裂

13、。細(xì)胞株潛伏期一般為細(xì)胞株潛伏期一般為624小時。小時。對數(shù)生長期：對數(shù)生長期： 細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進(jìn)行實驗研究。實驗研究。停止期（平臺期）停止期（平臺期）： 細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂細(xì)胞長滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂 機(jī)制：接觸抑制機(jī)制：接觸抑制第三節(jié)第三節(jié) 生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得 一、要求一、要求原代細(xì)胞原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞二倍體細(xì)胞50代以內(nèi)代以內(nèi)異倍體細(xì)胞異倍體細(xì)胞無限傳代無限傳代二、獲得二、獲得1、原代細(xì)胞、原代細(xì)胞細(xì)胞原代培養(yǎng)過程細(xì)胞原代培養(yǎng)過程2、二倍體細(xì)胞系、二倍

14、體細(xì)胞系原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選和克隆，從而從多種細(xì)胞成分的原代細(xì)胞經(jīng)過傳代、篩選和克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。特點：特點：（1）二倍體；）二倍體；（2）有明顯的貼壁和接觸抑制特性；）有明顯的貼壁和接觸抑制特性；（3）有限的增殖能力；）有限的增殖能力；（4）無致瘤性。）無致瘤性。3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系通過轉(zhuǎn)化形成，變成了異倍體，有無限增殖能力。通過轉(zhuǎn)化形成，變成了異倍體，有無限增殖能力。自發(fā)的轉(zhuǎn)化：自發(fā)的轉(zhuǎn)化：在傳代過程中自己轉(zhuǎn)變成可無限增殖的細(xì)胞在傳代過程中自己轉(zhuǎn)變成可無限增殖的細(xì)胞人為的轉(zhuǎn)化：人為的轉(zhuǎn)化

15、：采用某些試劑處理，或從動物的腫瘤組織中建采用某些試劑處理，或從動物的腫瘤組織中建立的細(xì)胞系立的細(xì)胞系優(yōu)點：優(yōu)點：（1）無限傳代；）無限傳代；（2）倍增時間短；）倍增時間短；（3）對培養(yǎng)條件和生長因子的要求低；）對培養(yǎng)條件和生長因子的要求低；（4）適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。）適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。4、融合細(xì)胞系、融合細(xì)胞系細(xì)胞融合細(xì)胞融合是指通過兩個或兩個以上的細(xì)胞合并成一個細(xì)胞是指通過兩個或兩個以上的細(xì)胞合并成一個細(xì)胞的過程。的過程。（1）概念）概念（2）動物細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展簡史：）動物細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展簡史：19世紀(jì)世紀(jì)30年代年代病理組織中發(fā)現(xiàn)多核細(xì)胞病理組織中發(fā)現(xiàn)多核細(xì)胞19世紀(jì)世紀(jì)

16、70年代年代蛙血細(xì)胞多核細(xì)胞蛙血細(xì)胞多核細(xì)胞1958年年滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)人的腹水癌細(xì)胞融合成功滅活的仙臺病毒誘導(dǎo)人的腹水癌細(xì)胞融合成功后來后來誘導(dǎo)了不同種動物的體細(xì)胞融合，并且能將雜種誘導(dǎo)了不同種動物的體細(xì)胞融合，并且能將雜種細(xì)胞培養(yǎng)成活細(xì)胞培養(yǎng)成活a. 仙臺病毒融合法仙臺病毒融合法（3）細(xì)胞融合的方法：）細(xì)胞融合的方法：b. 聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法 主要用于單克隆抗體主要用于單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞技術(shù)。的雜交瘤細(xì)胞技術(shù)。 c. 電融合法電融合法 利用細(xì)胞在短時間的強(qiáng)電場作用下，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性電擊穿，利用細(xì)胞在短時間的強(qiáng)電場作用下，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性電擊穿，而使相鄰的細(xì)胞膜相互發(fā)生繼發(fā)

17、性融合而使相鄰的細(xì)胞膜相互發(fā)生繼發(fā)性融合.v 操作簡便操作簡便v 無化學(xué)毒性無化學(xué)毒性v 對細(xì)胞損傷小對細(xì)胞損傷小v 融合同步，融合率高融合同步，融合率高v 可在顯微鏡下直接觀察可在顯微鏡下直接觀察優(yōu)點：優(yōu)點：5、重組工程細(xì)胞系、重組工程細(xì)胞系采用基因工程方法構(gòu)建工程細(xì)胞采用基因工程方法構(gòu)建工程細(xì)胞三、常用生產(chǎn)用動物細(xì)胞的特性三、常用生產(chǎn)用動物細(xì)胞的特性v BHK21BHK21：從地鼠幼鼠的腎臟中：從地鼠幼鼠的腎臟中分離。成纖維樣細(xì)胞，用于分離。成纖維樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程菌，可生產(chǎn)疫苗。構(gòu)建工程菌，可生產(chǎn)疫苗。舉例：舉例：v CHO-K1CHO-K1（中國倉鼠卵巢細(xì)（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）：從中國

18、地鼠卵巢中分胞）：從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞，用于構(gòu)建離的上皮樣細(xì)胞，用于構(gòu)建工程菌。工程菌。v MRC-5(MRC-5(人胎肺成纖維細(xì)胞人胎肺成纖維細(xì)胞)：人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，有限壽命胞，有限壽命42-4642-46代，用代，用于制備疫苗。于制備疫苗。v WI38WI38：人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，倍增：人二倍體細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，倍增時間為時間為 24 24 小時，有限壽命小時，有限壽命 50 50 代，用于制備疫苗。代，用于制備疫苗。四、細(xì)胞庫的建立四、細(xì)胞庫的建立用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞建立：用于生產(chǎn)的工程細(xì)胞建立：生產(chǎn)所需的細(xì)

19、胞生產(chǎn)所需的細(xì)胞生產(chǎn)用細(xì)胞庫（生產(chǎn)用細(xì)胞庫（MWCB）原始細(xì)胞庫（原始細(xì)胞庫（MCB）第四節(jié)第四節(jié) 動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基1、所有的與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液都必須保持絕對無菌，、所有的與細(xì)胞接觸的設(shè)備、器材和溶液都必須保持絕對無菌，避免污染；避免污染；2、必須有足夠的營養(yǎng)保證，絕對不可有有害的物質(zhì)，避免有害、必須有足夠的營養(yǎng)保證，絕對不可有有害的物質(zhì)，避免有害離子；離子；3、保證有適量的氧氣供應(yīng)；、保證有適量的氧氣供應(yīng)；4、需隨時清除細(xì)胞代謝中的有害產(chǎn)物；、需隨時清除細(xì)胞代謝中的有害產(chǎn)物；5、有良好的適于生存的外界環(huán)境，滲透壓、離子濃度和酸度；、有良好的適于生

20、存的外界環(huán)境，滲透壓、離子濃度和酸度；6、及時分種，保持合適的細(xì)胞密度。、及時分種，保持合適的細(xì)胞密度。動物細(xì)胞在體外培養(yǎng)所需基本條件動物細(xì)胞在體外培養(yǎng)所需基本條件v 玻璃器皿：玻璃器皿：培養(yǎng)瓶、滴管等培養(yǎng)瓶、滴管等 浸泡（自來水或稀酸）、刷洗（洗衣粉）、沖水、烘干、浸泡（自來水或稀酸）、刷洗（洗衣粉）、沖水、烘干、酸泡（酸泡（1212小時）、流水沖洗、蒸溜水沖洗、三蒸水沖洗，小時）、流水沖洗、蒸溜水沖洗、三蒸水沖洗，5050烘干烘干v 塑料器皿：塑料器皿：培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等。培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等。 自來水沖洗、洗衣粉超聲波清洗、沖水、晾干、酸泡（自來水沖洗、洗衣粉超聲波清洗、沖水、

21、晾干、酸泡（1212小時）、流水沖洗、蒸溜水沖洗、雙蒸水沖洗，晾干小時）、流水沖洗、蒸溜水沖洗、雙蒸水沖洗，晾干一、動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件一、動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件1. 器材的清洗和消毒器材的清洗和消毒（1）器材的清洗）器材的清洗（2）器材的消毒滅菌）器材的消毒滅菌a. 干熱消毒干熱消毒 電熱干燥箱電熱干燥箱: 160，60-120 min, 用于玻璃器皿用于玻璃器皿的消毒的消毒b. 濕熱消毒濕熱消毒 高壓蒸汽滅菌器高壓蒸汽滅菌器: 用于布類、用于布類、金屬器材、玻璃器皿、液金屬器材、玻璃器皿、液體、橡膠物品的消毒。體、橡膠物品的消毒。c. 紫外線消毒紫外線消毒 紫外燈：紫外燈：主要用于培養(yǎng)室空氣、操

22、作臺、塑料培養(yǎng)皿主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒和培養(yǎng)板等表面消毒 缺點缺點: 產(chǎn)生臭氧，影響身體健康。產(chǎn)生臭氧，影響身體健康。d. 過濾除菌消毒過濾除菌消毒 濾器：濾器：用于大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血用于大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、清、 酶液等均采用濾過法除菌。酶液等均采用濾過法除菌。 濾 器正壓不銹鋼過濾裝置示意圖正壓不銹鋼過濾裝置示意圖 e. 消毒劑和抗生素消毒劑和抗生素 消毒劑：消毒劑：75%酒精、過氧乙酸、新潔爾滅酒精、過氧乙酸、新潔爾滅 用于操作人員的皮膚、實驗臺、器械、器皿的操用于操作人員的皮膚、實驗臺、器械、器皿的操作表面、實驗室的

23、椅、桌、墻、地面等的消毒。作表面、實驗室的椅、桌、墻、地面等的消毒。 抗生素：抗生素：青霉素、鏈霉素等青霉素、鏈霉素等 用于預(yù)防培養(yǎng)用液的染菌用于預(yù)防培養(yǎng)用液的染菌n超凈工作臺的工作原理：超凈工作臺的工作原理：利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣通過高利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐空氣徐徐通過工作臺面，使徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。 超凈臺超凈臺超凈工作臺：超凈工作臺： 為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境自動雙重純水蒸餾器自動雙重純水蒸餾器純水儀純水儀水質(zhì)的好壞直接影響細(xì)胞

24、培養(yǎng)的成功與否水質(zhì)的好壞直接影響細(xì)胞培養(yǎng)的成功與否有毒元素、金屬離子、微生物污染。有毒元素、金屬離子、微生物污染。2. 水質(zhì)水質(zhì)v pH 7.27.4，最適，最適v pH 7.6，不利于細(xì)胞的生長，不利于細(xì)胞的生長3. pH pH的高低對細(xì)胞各種酶的活性，細(xì)胞的通透性、及許的高低對細(xì)胞各種酶的活性，細(xì)胞的通透性、及許多蛋白的功能有重要影響。水質(zhì)的好壞直接影響細(xì)胞多蛋白的功能有重要影響。水質(zhì)的好壞直接影響細(xì)胞培養(yǎng)的成功與否培養(yǎng)的成功與否 pH緩沖系統(tǒng)：如緩沖系統(tǒng)：如Na2HPO4/ NaH2PO4緩沖系統(tǒng)緩沖系統(tǒng) pH緩沖劑：緩沖劑：HEPES4. 滲透壓滲透壓 使用平衡鹽溶液（使用平衡鹽溶液（

25、BSS）保持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。）保持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。 成分主要為：無機(jī)鹽和葡萄糖，如成分主要為：無機(jī)鹽和葡萄糖，如Hanks平衡鹽。平衡鹽。5. 溫度溫度 動物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：動物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：37 昆蟲細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：昆蟲細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度：276. 空氣空氣 氧氣：氧氣：采用培養(yǎng)瓶等培養(yǎng)，不需專門通氣采用培養(yǎng)瓶等培養(yǎng)，不需專門通氣 采用生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)生產(chǎn)，要專門通氣采用生物反應(yīng)器大量培養(yǎng)生產(chǎn)，要專門通氣 CO2：細(xì)胞生長需要，又是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物。細(xì)胞生長需要，又是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物。 與維持培養(yǎng)基的與維持培養(yǎng)基的pH有關(guān)。有關(guān)。nCO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為3

26、7，5CO2n使用使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題：問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒。箱內(nèi)箱內(nèi)蒸餾水槽中蒸餾水槽中加入滅菌蒸餾水加入滅菌蒸餾水3000ml以保以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱二、動物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成二、動物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類和組成1. 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基生物性液體（如血清）生物性液體（如血清）組織浸液（如胚胎浸液）組織浸液（如胚胎浸液）凝固劑（如血漿）凝固劑（如血漿）

27、2. 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基BME, MEM, DMEM, HAM F12, RPMI1640等產(chǎn)品等產(chǎn)品合成培養(yǎng)基的成分合成培養(yǎng)基的成分（1）氨基酸）氨基酸 細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料細(xì)胞合成蛋白質(zhì)的原料 至少含至少含12種必需氨基酸種必需氨基酸+谷氨酰胺谷氨酰胺（2）維生素）維生素 維持細(xì)胞生命活動的低分子活性物質(zhì)，形成酶的輔維持細(xì)胞生命活動的低分子活性物質(zhì)，形成酶的輔基或輔酶基或輔酶 如維生素如維生素A、維生素、維生素D、維生素、維生素B2等。等。（3）糖類）糖類 碳源，如葡萄糖。碳源，如葡萄糖。（4）無機(jī)鹽）無機(jī)鹽 保持細(xì)胞的滲透壓并，緩沖保持細(xì)胞的滲透壓并，緩沖pH的變化，并參與代謝。的變化

28、，并參與代謝。 如如 NaCl, KCl, MgSO4, Na2HPO4等。等。（5）其他成分）其他成分 核酸前體，如腺苷、鳥苷等。核酸前體，如腺苷、鳥苷等。 氧化還原劑，如谷胱甘肽等。氧化還原劑，如谷胱甘肽等。 動物血清，如小牛血清、胎牛血清。動物血清，如小牛血清、胎牛血清。添加小牛血清的作用：添加小牛血清的作用：1、提供有利于細(xì)胞生長增殖所需的各種、提供有利于細(xì)胞生長增殖所需的各種生長因子生長因子和和激素激素； 如，胰島素、表皮生長因子等；皮質(zhì)醇、雌二醇等。如，胰島素、表皮生長因子等；皮質(zhì)醇、雌二醇等。2、提供有利于細(xì)胞貼壁所需的、提供有利于細(xì)胞貼壁所需的貼附因子貼附因子和和伸展因子伸展因

29、子； 如，纖維結(jié)合蛋白、膠原等。如，纖維結(jié)合蛋白、膠原等。3、提供可識別金屬、激素、維生素和脂類的、提供可識別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白； 如，白蛋白等。如，白蛋白等。4、提供細(xì)胞生長所必需的、提供細(xì)胞生長所必需的脂肪酸脂肪酸和和微量元素微量元素。 如，膽固醇、前列腺素如，膽固醇、前列腺素E等。銅、鋅、硒等。等。銅、鋅、硒等。3. 無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基1. 提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了血清差異所帶來的細(xì)胞差異；提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了血清差異所帶來的細(xì)胞差異；2. 減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險；減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生

30、物污染的危險；3. 供應(yīng)充足、穩(wěn)定；供應(yīng)充足、穩(wěn)定；4. 細(xì)胞產(chǎn)品易于純化；細(xì)胞產(chǎn)品易于純化；5. 避免了血清中某些因素對有些細(xì)胞的毒性；避免了血清中某些因素對有些細(xì)胞的毒性；*6. 減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于結(jié)果分析。減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于結(jié)果分析。優(yōu)點：優(yōu)點：合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 + 激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因激素、生長因子、結(jié)合蛋白、貼附和伸展因子及其他元素子及其他元素第五節(jié)第五節(jié) 動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法一、細(xì)胞分離一、細(xì)胞分離1. 離心分離法離心分離法 從含有細(xì)胞的體液中分離細(xì)胞。從含有細(xì)胞的體液中分離細(xì)胞。如血液、

31、羊水、腹水等。如血液、羊水、腹水等。 8001000 r/min, 510 min2. 消化分離法消化分離法 生物體生物體組織塊組織塊剪碎剪碎消化消化終止消化終止消化200目濾目濾網(wǎng)過濾網(wǎng)過濾單細(xì)胞懸液單細(xì)胞懸液常用的幾種消化液：常用的幾種消化液： （1）1%胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 （2）0.02%EDTA溶液溶液 （3）胰酶）胰酶-檸檬酸鹽檸檬酸鹽 （4）胰酶）胰酶-EDTA溶液溶液二、細(xì)胞計數(shù)二、細(xì)胞計數(shù)1. 自動細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)：自動細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)：Coulter計數(shù)儀計數(shù)儀2. 血球計數(shù)板計數(shù)：血球計數(shù)板計數(shù)：區(qū)分死活細(xì)胞：區(qū)分死活細(xì)胞：臺盼藍(lán)染色、苯胺黑染色臺盼藍(lán)染色、苯胺黑染色計算

32、：計算：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml（四個大格子細(xì)胞數(shù)（四個大格子細(xì)胞數(shù)/4) 1104 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)公式中乘以公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：1.0mm（長）（長）1.0mm（寬）（寬）0.1mm（高）（高）0.1mm3 而而 1ml1000mm33. 結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計數(shù)法：結(jié)晶紫染色細(xì)胞核計數(shù)法： 細(xì)胞分散解離、破碎，細(xì)胞核藍(lán)色。血球計數(shù)板計數(shù)。細(xì)胞分散解離、破碎，細(xì)胞核藍(lán)色。血球計數(shù)板計數(shù)。4. MTT染色計數(shù)法：細(xì)胞存活率檢測染色計數(shù)法：細(xì)胞存活率檢測 四甲基偶唑鹽（四甲基偶唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)。）商品名為

33、噻唑藍(lán)。 MTT 比色法的原理：活細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶能將比色法的原理：活細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶能將MTT還還原成不溶干水的紫色產(chǎn)物，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有原成不溶干水的紫色產(chǎn)物，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中紫色結(jié)）能溶解沉積在細(xì)胞中紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的紫色結(jié)晶量成正比。再用酶標(biāo)晶物，溶液顏色深淺與所含的紫色結(jié)晶量成正比。再用酶標(biāo)儀測定儀測定OD值。值。 操作步驟操作步驟: :（1 1）單細(xì)胞懸液接種于）單細(xì)胞懸液接種于9696孔培養(yǎng)板；孔培養(yǎng)板；3737、5 5COCO2 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時

34、間（根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間）（2 2）加入）加入MTTMTT液繼續(xù)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3-43-4小時。小時。（3 3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSODMSO液，液，將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩1010分鐘，使結(jié)晶物溶解。分鐘，使結(jié)晶物溶解。（4 4）酶標(biāo)儀檢測各孔）酶標(biāo)儀檢測各孔ODOD值（檢測波長值（檢測波長490 nm490 nm）。）。培養(yǎng)板培養(yǎng)板孔板振蕩器孔板振蕩器酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有根據(jù)細(xì)胞生長的恃點，傳代方法有3種種1.懸浮生長細(xì)胞傳代懸浮生長細(xì)胞傳代加入培養(yǎng)液，分瓶培養(yǎng)。加入培養(yǎng)

35、液，分瓶培養(yǎng)。2.半懸浮生長細(xì)胞傳代（半懸浮生長細(xì)胞傳代（Hela細(xì)胞）細(xì)胞）此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來，進(jìn)行傳代。3.貼壁生長細(xì)胞傳代貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。三、細(xì)胞傳代三、細(xì)胞傳代貼壁生長細(xì)胞傳代方法：貼壁生長細(xì)胞傳代方法：v 吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液v 加入加入1-2ml0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底以消化液能覆蓋整個瓶

36、底為準(zhǔn)）靜置為準(zhǔn)）靜置2-10min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。v 吸吸去去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。v 用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。液。v 吸取細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，吸取細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，1傳傳2或或1傳傳3。v 加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)。v 將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作。細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以

37、減少人力、經(jīng)費，減凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少人力、經(jīng)費，減少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。少污染，減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化。四、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇四、細(xì)胞凍存和復(fù)蘇1、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融、凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶。 復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小

38、冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。的重結(jié)晶。（1）慢凍程序：）慢凍程序：程序降溫盒程序降溫盒： 1/min降溫降溫4 4-20-20-80-80液氮液氮（2）低溫保護(hù)劑的應(yīng)用：）低溫保護(hù)劑的應(yīng)用：2、細(xì)胞的凍存、細(xì)胞的凍存v 在細(xì)胞凍存時加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。在細(xì)胞凍存時加入低溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。v 常用的低溫保護(hù)劑是常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透

39、出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。（3）細(xì)胞凍存方法）細(xì)胞凍存方法v 預(yù)先配制凍存液：預(yù)先配制凍存液：含血清培養(yǎng)基，含血清培養(yǎng)基，10%DMSO。v 取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液,用用吸管吹打制成細(xì)胞懸液。吸管吹打制成細(xì)胞懸液。v 加入加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。凍日期。v 從液氮中取出冷凍管，迅速投入從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738水浴中，搖動水浴中，搖動使其融化（使其

40、融化（1分鐘左右）。分鐘左右）。v 用培養(yǎng)液稀釋至原體積的用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。倍以上。v 低速離心低速離心5分鐘。分鐘。v 去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞。v 隔天觀察細(xì)胞生長情況，并換液。隔天觀察細(xì)胞生長情況，并換液。3、細(xì)胞的復(fù)蘇、細(xì)胞的復(fù)蘇第六節(jié)第六節(jié) 動物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法動物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式和操作方式一、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法一、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法實際生產(chǎn)可分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和貼壁懸浮培養(yǎng)。實際生產(chǎn)可分為懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和貼壁懸浮培養(yǎng)。1、懸浮培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡單、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳

41、氧比較好，操作簡單、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧比較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗。容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，可借鑒細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗。缺點：缺點：由于細(xì)胞體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。由于細(xì)胞體積小，較難采用灌流培養(yǎng)。*2、貼壁培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)優(yōu)點：優(yōu)點：適用的細(xì)胞種類多，較容易采用灌流培養(yǎng)，達(dá)到高適用的細(xì)胞種類多，較容易采用灌流培養(yǎng)，達(dá)到高密度細(xì)胞。密度細(xì)胞。缺點：缺點：操作比較復(fù)雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，操作比較復(fù)雜，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。3、貼壁、貼壁-懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)（1）微載體培養(yǎng)）微載體培養(yǎng)v 將對細(xì)胞

42、無害的顆粒將對細(xì)胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時通液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。優(yōu)點：優(yōu)點：1、可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積，、可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積， 2、載體體積較小，比重較輕，輕度攪拌即可攜帶、載體體積較小，比重較輕，輕度攪拌即可攜帶細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的特長。細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)，發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的特長。微載體的條件微載體的條件. .表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容性. .微載體的材料無毒性微

43、載體的材料無毒性. .微載體的材料是惰性的微載體的材料是惰性的. .微載體的比重在微載體的比重在1.0301.0301.045 g/ml1.045 g/ml. .粒徑在粒徑在6060250m250m之間，且均一之間，且均一. .具良好的光學(xué)透明性具良好的光學(xué)透明性. .基質(zhì)軟基質(zhì)軟. .耐高溫耐高溫. .可反復(fù)使用可反復(fù)使用10.10.原料充分，制作簡便，廉價原料充分，制作簡便，廉價（2）包埋和微曩培養(yǎng)）包埋和微曩培養(yǎng)優(yōu)點：優(yōu)點：1. 包埋或包裹在凝膠載體和微曩內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，包埋或包裹在凝膠載體和微曩內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害；避免了剪切力的損害；2. 可以獲得較高的細(xì)胞密度

44、；可以獲得較高的細(xì)胞密度；3. 通過控制微曩膜的孔徑，可使產(chǎn)品濃縮在微曩內(nèi)，有通過控制微曩膜的孔徑，可使產(chǎn)品濃縮在微曩內(nèi)，有利于下游產(chǎn)物的純化處理；利于下游產(chǎn)物的純化處理；4. 可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)將細(xì)胞包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)。將細(xì)胞包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)。（3）結(jié)團(tuán)培養(yǎng)）結(jié)團(tuán)培養(yǎng)利用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方利用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法進(jìn)行培養(yǎng)。法進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡單、節(jié)省微載體成本。操作簡單、節(jié)省微載體成本。二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式二、動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式1.分批式操作分批式操作

45、分批式培養(yǎng)中，細(xì)胞接種于固定體積的培養(yǎng)基中，分批式培養(yǎng)中，細(xì)胞接種于固定體積的培養(yǎng)基中，隨著細(xì)胞的增殖，營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物累積。最隨著細(xì)胞的增殖，營養(yǎng)物質(zhì)消耗，代謝產(chǎn)物累積。最后，營養(yǎng)耗盡，細(xì)胞增殖停止。后，營養(yǎng)耗盡，細(xì)胞增殖停止。 改進(jìn)：改進(jìn)：通過培養(yǎng)基的各種補(bǔ)加方式，提高產(chǎn)量。通過培養(yǎng)基的各種補(bǔ)加方式，提高產(chǎn)量。2.半連續(xù)式操作半連續(xù)式操作 間斷以新鮮培養(yǎng)基（或連同新鮮載體一起）更換間斷以新鮮培養(yǎng)基（或連同新鮮載體一起）更換固定體積培養(yǎng)基（或連同細(xì)胞載體一起），繼續(xù)培養(yǎng)。固定體積培養(yǎng)基（或連同細(xì)胞載體一起），繼續(xù)培養(yǎng)。.灌流式操作灌流式操作 通過不斷向培養(yǎng)系統(tǒng)中加入新鮮培養(yǎng)基并且從反應(yīng)

46、通過不斷向培養(yǎng)系統(tǒng)中加入新鮮培養(yǎng)基并且從反應(yīng)器中打出已經(jīng)使用過的培養(yǎng)液（器中打出已經(jīng)使用過的培養(yǎng)液（無細(xì)胞無細(xì)胞）。）。工業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展趨勢工業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展趨勢v以高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)代替間歇批式培養(yǎng)以高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)代替間歇批式培養(yǎng)v以生物反應(yīng)器系統(tǒng)代替手工操作的轉(zhuǎn)瓶或方瓶以生物反應(yīng)器系統(tǒng)代替手工操作的轉(zhuǎn)瓶或方瓶培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)v以懸浮培養(yǎng)技術(shù)代替貼壁培養(yǎng)技術(shù)以懸浮培養(yǎng)技術(shù)代替貼壁培養(yǎng)技術(shù)v以無血清培養(yǎng)代替有血清培養(yǎng)以無血清培養(yǎng)代替有血清培養(yǎng)第七節(jié)第七節(jié) 動物細(xì)胞制藥的前景與展望動物細(xì)胞制藥的前景與展望一、改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量一、改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量提高細(xì)胞表達(dá)的水平，主要靠對表達(dá)系統(tǒng)的改造。提高細(xì)胞表達(dá)的水平，主要靠對表達(dá)系統(tǒng)的改造。包括：包