影響Westernblot地因素

1、WORD格式Western blotting的影響因素一：電泳W(wǎng)estern blotting 是一個步驟繁多的實驗。很多的操作過程，每一步都會對最后的結(jié)果產(chǎn)生影響，接下來的這幾個帖子我想把我這段時間做 Western blotting 總結(jié)的一些影響實驗結(jié)果的因素寫下來，如果你有更好的建議，希望也能奉獻(xiàn)出來，大家一起學(xué)習(xí)進(jìn)步。電泳過程是第一步， 也是很重要的一步， 好的電泳能讓目的條帶整齊， 就像人工畫的。 要做好電泳也并非易事，我總結(jié)有這些方面的因素能影響電泳效果：1. 樣品質(zhì)量。所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的 PH 值是否在 78 之間。這會直接影響到樣品濃

2、縮的效果。 此外， 蛋白樣品是否降解、 目的蛋白是否已抽取充分都會對最終結(jié)果的可靠性有影響。2.凝膠質(zhì)量。不連續(xù)SDS-PAGE 膠對凝膠的要求較高，具體的影響因素有：1.別離膠的PH 值應(yīng)在 8.8 左右，而濃縮膠的 PH 應(yīng)在 6.8 左右，最好不要差過 0.5 個 PH 單位，因為這個 PH 條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此，制備凝膠的時候所用Tris-HCl 緩沖液的 PH 值是否穩(wěn)定是很重要的。2.所用丙烯酰胺的純度和凝膠聚合時間， 不純的丙烯酰胺會含有丙烯酸， 它會影響到凝膠內(nèi)部局部PH 環(huán)境，因此會影響電泳的效果，沒有聚合充分的凝膠會

3、含有游離的丙烯酰胺，也會影響到局部PH環(huán)境， 它們還會與蛋白上的氨基、 巰基以及酚羥基反響影響蛋白的泳動。凝膠聚合時間以分離膠 45min ，濃縮膠 20min為宜。此外，單體放置時間過長也會造成丙烯酸的累積。3.凝膠母液混合是否均勻也會影響到凝膠濃度的分布。4.配備的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也會影響到網(wǎng)孔的大小，因此也會對電泳的質(zhì)量有影響，一般取3040： 1，特殊要求的實驗也可以靈活變動。5.APS 及 TEMED 的參加量， APS 極易潮解而失去活性，因此最好是現(xiàn)用現(xiàn)配， APS 不宜參加過多，否那么會氧化蛋白樣品。TEMED 作為加速劑，有利于氧自由基的富集， 從而加速聚合

4、反響， 因此所用的TEMED 盡量不要被氧化 氧化后發(fā)黃 ，還有參加的 TEMED 也不宜過多或過少，過多會升高PH 值并能與蛋白反響，過少那么會造成聚合不充分， 網(wǎng)孔變大， 并且造成游離丙烯酰胺單體的增多，它們也會和蛋白反響以及改變局部 PH。 6.點樣孔底部要平整。3.點樣。樣品盡量不要與電泳液混合，這樣能提高濃縮的效果，因為電泳液PH 值為 8.3，而樣品為7.5，混合后會影響到樣品的PH 值，進(jìn)而影響濃縮效果。因此，建議點樣最好用長槍頭，或者加樣器，輕輕的將樣品加到孔的底部。還有，加樣之前最好先沖洗一下加樣孔底部， 減少沒有聚合的丙烯酰胺的影響。還有，盡量從加樣孔的中間點樣，這樣能使得

5、樣品在加樣孔中的濃度分布盡量均勻，這也會對最終蛋白條帶的形狀有影響的。加樣量也不能過高或過低，過高會影響條帶的形狀，過低不利于后面的雜交反響。專業(yè)資料整理WORD格式4.電泳緩沖液。盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH 值和離子強度的穩(wěn)定。專業(yè)資料整理WORD格式5.電壓條件。電壓過高，一方面會使凝膠溫度上升，改變凝膠內(nèi)部PH值，甚至?xí)斐扇軐I(yè)資料整理WORD格式膠，另一方面，電流過大也不利于蛋白分子的別離，容易造成條帶變形，電壓過低，又會有樣品擴散的影響。我們經(jīng)常用的濃縮時 80V ，別離時 100V 比較好，條帶很平。專業(yè)資料整理WORD格式6.其他的因素，如做膠的玻璃板要干凈，底下或上面不

6、能有雜質(zhì)如鐵銹等，加別離膠之前要把上面的有機相洗干凈， 并盡量吸干水分。 膠板加到電泳槽之后檢查膠板底部是否有氣泡，有的話用槍吹走，這個會嚴(yán)重影響電流方向，進(jìn)而影響電泳效果。二：轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜是對 western boltting 最終結(jié)果影響最大的一步，磚模質(zhì)量的好壞直接決定了實驗結(jié)果的好壞。轉(zhuǎn)膜的影響因素不多，主要有膜的選擇、轉(zhuǎn)印方法和實驗操作三個方面。首先是膜的選擇問題。 膜的選擇主要從實驗?zāi)康暮蛯嶒炓髞砜紤]。 例如，要做分子量小于 20kD 的小蛋白， 0.45 m的 NC膜是不可取的，因為這樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白量不確定， 從而影響到最終結(jié)果的可靠性。 而如果所

7、別離的蛋白需要進(jìn)展測序，那么非 PVDF膜不可，因為只有 PVDF膜才能經(jīng)受住嚴(yán)酷的清洗條件。 常用的 Western 用膜有 NC膜、 PVDF膜和尼龍膜，它們的一些主要的特點總結(jié)如下表：專業(yè)資料整理WORD格式nameNC膜尼龍膜靈敏度和 高高分辨率背景低較高結(jié)合能力80110 ug/cm2400 ug/cm2材料質(zhì)地干的 NC膜易脆軟而結(jié)實溶劑耐受無無性操作程序緩沖液潤濕 ,防止氣緩沖液潤濕泡常規(guī)染色， 可用放射檢測方式不能用陰離子染料性和非放射性檢測PVDF膜高低125200 ug/cm2 適合于 SDS存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合機械強度高有使用前 100%甲醇潤濕常規(guī)染色， 比較于 NC膜

8、，可用考馬斯亮藍(lán)染色，可用于 ECL檢測，快速免疫檢測。專業(yè)資料整理WORD格式0.45um 一般蛋白0.2um 一分子量小于低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖適用X圍20kD 蛋白蛋白和蛋白多糖( 主要用在核酸檢糖蛋白檢測和蛋白質(zhì)測序0.1um 一分子量小于測中 )7kD 蛋白專業(yè)資料整理WORD格式價格價格較廉價廉價較貴專業(yè)資料整理WORD格式其次是轉(zhuǎn)膜方法的選擇。主要有半干法轉(zhuǎn)膜和濕法轉(zhuǎn)膜。半干法操作要求高，但效率也高。濕法操作要求相對低，花時間多一些。最后是實驗操作方面的問題。使用PVDF膜的時候需要進(jìn)展預(yù)處理，這里面會帶來一些問題， 如甲醇潤濕不夠，膜的有些區(qū)域不能很好的結(jié)合蛋白就會引入

9、誤差。膜上面一定不要有油脂類的東西，否那么也會影響蛋白結(jié)合和抗體的雜交。(三)：抗體雜交與底物顯色Western blot 最常用的檢測方法就是用一抗和二抗的方法，其它的如用生物素-鏈霉親和素或者 Protein G/A 的方法由于用的比較少，就不在此討論了。使用一抗和二抗的檢測方法是基于信號放大的原理，加大了檢測的靈敏度。當(dāng)然這樣做也能減少本錢和提高效率，我們只需要優(yōu)先的幾種標(biāo)記的特異性好的二抗就能滿足大量的實驗要求?？贵w雜交方面能影響最后實驗結(jié)果的因素不多。首先是一抗的選擇，盡量選擇小鼠或者兔來源的單克隆抗體，還有要注意所用的抗體是否能夠識別變性條件下的目標(biāo)蛋白，一般說明書里標(biāo)明可以用于W

10、B 的都是可以用來做Western 的。盡量選擇小鼠或者兔來源是考慮到其他實驗如果要用這種抗體的話，這兩種來源的會增加適用X圍。單抗的特異性好， 能減少非特異條帶。其次是一抗的雜交條件，一般用4過夜為好，當(dāng)然首先尊重說明書中的建議。再其次就是一抗洗滌的條件，一般采用含0.5 1.0 Tween-20 的 TBST 來洗， 5 分鐘一次，洗 3 至 5 次即可，如果遇到背景比較臟的情況，也可以適當(dāng)提高吐溫的含量。二抗一般都是效價很高的， 只要室溫下雜交1 小時就可以了， 適當(dāng)延長也是可以的。 抗體的稀釋倍數(shù)是由顯色方法決定的，可以先用說明書建議的稀釋條件做一下，再根據(jù)結(jié)果調(diào)整稀釋倍數(shù)。顯影或顯色

11、這一步對結(jié)果的影響是非常大的。用熒光素、同位素或者生物素標(biāo)記的不常用，就不討論了，最常用的是用標(biāo)記的，常用的標(biāo)記酶包括辣根過氧化物酶HRP HorseradishPeroxidase，屬于過氧化物酶POD 類和堿性磷酸酶 AP Alkaline Phosphatase ，此外還有比較少見的葡萄糖氧化酶Glucose Oxidase、半乳糖苷酶 -Galactosidase。這些酶類主要有兩種檢測方法：底物顯色和化學(xué)發(fā)光。HRP 辣根過氧化酶是最常見的酶促發(fā)光或顯色的交聯(lián)酶，由于 HRP 比活高、 特異性更強、分子量小 40kD 、穩(wěn)定和作用底物X圍廣的優(yōu)點而得到廣泛使用。HRP 的底物種類有不

12、少， 主要可以分為化學(xué)發(fā)光底物和生色底物2 大類。對于底物的選擇， 主要考慮的是靈敏度、背景和使用的方便性和穩(wěn)定性。HRP 的生色底物顯色有DAB ，4-CN ，CN/DAB ，AEC和 TMB 等而得到可溶性產(chǎn)物的底物如 OPD，ABTS 等那么適用于 ELISA 中。這幾種顯色底物的各種性能的比較見下表：底物DAB4-CNAECTMB學(xué)名 3,3-diaminobenzidine4-chloro-1-naphthol3-amino-9-ethyl3,3,5,5tetrahydrochloridecarbazoltetramethylbenzidine分子 214.14178.58210.2

13、8240.4量穩(wěn)定 好一般避光好性靈敏 250pg1ng100pg專業(yè)資料整理WORD格式度背景 一般低高高終產(chǎn) 不能很好的成像容易成像容易成像物成像性顏色 褐色介于藍(lán)色與藍(lán)紫色之間可 棕紅色藍(lán)紫色用于 double-staining毒性 有疑有治癌作用無有無HRP 化學(xué)發(fā)光反響底物可以用琳瑯滿目來形容。常見的化學(xué)發(fā)光底物包括Luminol 、 GEHealthcare原安瑪西亞的ECL 系列，還有Pierce 公司的 SuperSignal 系列等。 Luminol 系列是經(jīng)典的HRP 化學(xué)發(fā)光底物，但現(xiàn)在開展出來的高效的化學(xué)發(fā)光底物更受歡迎。ECL 在許多研究人員心目中的幾乎成為化學(xué)發(fā)光法的代名詞，有時竟然是高品質(zhì)文章的保證之一，可見其經(jīng)典。 GE Healthcare 公司后來推出的 ECL Plu