《肽與蛋白質(zhì)》備課材料

1、肽與蛋白質(zhì)備課材料楊旭2000年9月3日于北京開始準(zhǔn)備第一章：緒論（2學(xué)時）關(guān)于我們的教材和教學(xué)大綱本書蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)是高等教育出版社出版的大學(xué)教材。專供生化專業(yè)和分子生物學(xué)專業(yè)的本科學(xué)生使用。我們現(xiàn)在拿到手的是第二版第二次印刷本（1999年11月）。是目前國內(nèi)可以找到的最新版本的該課教材。目前北京大學(xué)生化本科學(xué)生也在使用本教材。- 該教材由北京大學(xué)生命科學(xué)院茹炳根教授（國家教委任命的本書主審）親白推薦，茹教授是我國“蛋白質(zhì)與肽”領(lǐng)域的學(xué)科帶頭人。- 我們采用的教學(xué)大綱也是茹教授所編寫的。一、蛋白質(zhì)的重要地位（pp1-1）組成生命的最基本的物質(zhì)：水、蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、糖類、無機(jī)鹽。生物體是靠

2、蛋白質(zhì)來進(jìn)行和完成生物功能的蛋白質(zhì)和肽領(lǐng)的研究是生命科學(xué)的重要組成部分之一，是生命科學(xué)的前沿。人類基因組研究計劃（HumanGenomeProject,HGP）以趨完成，后人類基因組研究計劃將包括（谷志遠(yuǎn)，第173頁）：基因克隆計劃；基因組多樣性計劃；CDNA（互補(bǔ)DNA）計劃；以上三項都是HPG計劃的延伸蛋白質(zhì)計劃：從基因圖譜轉(zhuǎn)化出蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)（信息的-電腦；物質(zhì)的-體外翻譯），大規(guī)模地研究基因產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)與功能；- 細(xì)胞計劃：以信號傳遞為主線，闡明發(fā)生在細(xì)胞中的生命現(xiàn)象的奧秘。蛋白質(zhì)計劃、細(xì)胞計劃則比前三項更具有開創(chuàng)性。二、蛋白質(zhì)的組成（pp1-7）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式：氨基酸的

3、共同特點是：與短，基相鄰的a-碳原子都有一個氨基，故稱a-氨基酸，結(jié)構(gòu)通式如下。各種氨基酸的區(qū)別在于側(cè)鏈基團(tuán)（R-基團(tuán)）不同。氨基酸分類：- 構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸：共20種，都是L-構(gòu)型的a-氨基酸；氨基酸衍生物：共5種：L-胱氨酸、L-羥脯氨酸、L-羥賴氨酸、L-甲狀腺素、鎖鏈素；非蛋白質(zhì)氨基酸：200多種，常見的如表1-4所示。- 按構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸按側(cè)鏈基團(tuán)的物理性質(zhì)分類：見表1-1脂肪族類：甘氨酸G、丙氨酸A、氨酸V、亮氨酸L、異亮氨酸I;羥基類：絲氨酸S、蘇氨酸T;(OH)酸性氨基酸：天冬氨酸D、谷氨酸E;(2個愈基：一C00)堿性氨基酸：組氨酸H、賴氨酸K、精氨酸R;(含氨基或胺基

4、)酰胺類：天冬酰胺N、谷氨酰胺Q;(酰胺基)含硫類：半胱氨酸C、甲硫氨酸(蛋氨酸)M;(含硫)芳香族類：苯丙氨酸F、酪氨酸Y、色氨酸W;(含苯環(huán))亞氨基酸：脯氨酸P(唯一不符合通式的氨基酸)。按構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸按側(cè)鏈基團(tuán)的疏水性分類：- 疏水氨基酸：丙氨酸A、氨酸V、亮氨酸L、異亮氨酸I、甲硫氨酸M、脯氨酸P、苯丙氨酸F、色氨酸W(gt>0.5);強(qiáng)親水氨基酸：天冬氨酸D、谷氨酸E、組氨酸H、賴氨酸K、精氨酸R(酸性堿性氨基酸)(gt<-2.5)。弱親水氨基酸：所有其它氨基酸(Agt-0.30.4)。按構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸按側(cè)鏈基團(tuán)的帶電荷情況分類：- 不帶電荷：絲氨酸S、蘇氨酸T

5、、天冬酰胺N、谷氨酰胺Q、半胱氨酸C、酪氨酸Y(羥基類、酰胺類等);中性溶液帶負(fù)電荷：天冬氨酸D、谷氨酸E(酸性氨基酸)；中性溶液帶正電荷：組氨酸H、賴氨酸K、精氨酸R(堿性氨基酸)。、蛋白質(zhì)的分類(pp7-8)按蛋白質(zhì)化學(xué)組成分類：簡單蛋白質(zhì)、結(jié)合蛋白質(zhì)簡單蛋白質(zhì)進(jìn)一步分為七小類(根據(jù)溶解性質(zhì)的不同)：- 清蛋白類(albumins):又稱為白蛋白，營養(yǎng)成份；球蛋白類(globulins):例如：免疫球蛋白；組蛋白類(histones);存在于染色體中；精蛋白類(protamines):存在于精子中；谷蛋白類(glutelins):存在于禾本植物種子；醇溶蛋白類(prolamines);溶于

6、7080%L醇；硬蛋白類(scleroproteins)：角蛋白、膠原蛋白、絲心蛋白。結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)一步分為七小類(根據(jù)非蛋白質(zhì)成分的不同)：糖蛋白類(glycoproteins):與糖類結(jié)合；核蛋白類(nucleoproteins)：與核酸結(jié)合；脂蛋白類(lipoproteins):與脂類結(jié)合；磷蛋白類(phosphoproteins):與磷酸共價結(jié)合的蛋白質(zhì)；金屬蛋白類(metalloproteins):與金屬離子直接結(jié)合的蛋白質(zhì)；血紅素蛋白類(hemoproteins):與血紅素結(jié)合的蛋白質(zhì)；黃素蛋白質(zhì)(flavoproteins):與黃素核昔酸結(jié)合的蛋白質(zhì)。其他分類：按功能分類、按蛋白質(zhì)

7、空間結(jié)構(gòu)分類。L-:是D-構(gòu)型氨基酸的立體異構(gòu)體，蛋白質(zhì)中都是L-構(gòu)型氨基酸(具有L旋光性)。a-碳原子：聯(lián)接氨基酸四個取代基(愈基、氨基、氫原子、側(cè)鏈(R-)基團(tuán)的碳原子。pK:解離常數(shù)。pl=1/2(pKi+pK2)；pl:等電位點，蛋白質(zhì)在溶液不向正或負(fù)極移動。四、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)簡介：肽鍵(peptidebond):是一分子的氨基酸的a-愈基與另一分子氨基酸的a-氨基脫水縮合而成的酰胺鍵(-COOH+-NH2=-CO-NH-+H20)。多肽鏈(polypeptidechain)、氨基末端(aminoterminal)、愈基末端(carboxylterminal):許多氨基酸借助肽鍵連接成的長

8、鏈稱為多肽鏈。多肽鏈的兩端的a-氨基和a-愈基都是游離的，一般將多肽鏈游離的a-氨基(寫在分子式左邊)稱為氨基末端或N端；游離的a-愈基(寫在分子式右邊)稱為愈基末端或C端。肽(peptide)、多肽(polypeptide)、蛋白質(zhì)(protein):由氨基酸脫水縮合的化合物稱為肽(或稱縮氨酸)；通常將10個以上氨基酸組成的肽稱為多肽；分子量大于5000(約4050個氨基酸殘基)且具有穩(wěn)定的高級構(gòu)象(空間結(jié)構(gòu))的稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)層次：一級結(jié)構(gòu)f二級結(jié)構(gòu)f超二級結(jié)構(gòu)f結(jié)構(gòu)域f三級結(jié)構(gòu)f四級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)(primarystructure):又稱化學(xué)結(jié)構(gòu)，指的是蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列

9、順序，包括組成一個蛋白質(zhì)分子的多肽鏈的數(shù)目和多肽鏈中氨基酸的精確序列兩個重要方面。二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure):指的是多肽鏈主鏈骨架中若干肽段各白沿著某個軸盤旋或折疊，并以氫鍵維持，從而形成有規(guī)律的構(gòu)象(空間結(jié)構(gòu))。如a-螺旋、B-折疊、B-轉(zhuǎn)角等。超二級結(jié)構(gòu)(supersecondarystructure):指的是蛋白質(zhì)分子中的一些二級結(jié)構(gòu)單元，在空間進(jìn)一步聚集、組合在一起，形成的一種高于二級低于三級結(jié)構(gòu)的新的空間層次。常見的超二級結(jié)構(gòu)有aa、BaB、BT3>333等。結(jié)構(gòu)域(domain):指的是由超二級結(jié)構(gòu)形成的緊密、穩(wěn)定，而且在蛋白質(zhì)分子構(gòu)象上明顯可分的區(qū)域。

10、一般由50-400個氨基酸組成，它們分別擔(dān)負(fù)蛋白質(zhì)分子的不同功能，是蛋白質(zhì)分子的生物功能實體。三級結(jié)構(gòu)(tertiarystructure):指的是一條多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，由于其順序相隔較遠(yuǎn)的氨基酸殘基側(cè)鏈的互相作用(氫鍵、疏水鍵、范德華力、離子鍵、配位鍵、二硫鍵)，而進(jìn)行范圍廣泛盤旋和折疊，從而產(chǎn)生特定的不規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)。四級結(jié)構(gòu)(quarternarystructure):指的是各個亞基(亞單位)在多聚蛋白中的空間排布及亞基的互相作用。第三章：蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定（7學(xué)時）第一節(jié)：蛋白質(zhì)序列測定的基本戰(zhàn)略和步驟（pp86-88）一、序列測定的基本戰(zhàn)略（pp86-87）S.Moore基本

11、戰(zhàn)略（又稱兩種或兩種以上的特異性裂解）這種戰(zhàn)略由美國科學(xué)家S.Moore于50年首創(chuàng)，且至今仍在沿用。它的要點是：用兩種方法分別將蛋白質(zhì)的肽鏈專一性的切斷，各白得到一系列的肽段；將這些肽段分離純化，測出它們的序列；將兩套肽序列的結(jié)果對在一起，得到蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。原則上，只要兩套斷鏈的切點都不同，就能解出一級結(jié)構(gòu)。（圖3-1A）由于此法所用的試劑易得，所以現(xiàn)在仍然被廣泛使用。（參見111頁，圖3-15）特異性裂解，根據(jù)裂解的方法可以分為兩類：酶法裂解：產(chǎn)生的肽較小（5-20個殘基），適用于手工序列分析；化學(xué)法裂解：產(chǎn)生的肽較大（50-100個殘基），適用于序列機(jī)分析。逐級特異性裂解戰(zhàn)略（見圖3

12、-1B）是70年代后提出的方案。此法優(yōu)點是：可以防止盲目性，有利于以后肽鏈的重排，也可以使分離純化簡單；缺點是：所需的斷裂試劑種類多，選擇合適的斷裂試劑很難。選擇測序戰(zhàn)略的主要依據(jù)所掌握和具備的肽鏈裂解方法；所具備的分離純化條件；尋找接頭肽（重疊肽）。二、序列測定前的準(zhǔn)備工作及測定的一般步驟（pp87-88）、序列測定前的準(zhǔn)備工作1.蛋白質(zhì)制劑的提純和純度要求：蛋白質(zhì)制劑的提純方法詳見第二章。一般要求其純度在97%以上，如果雜蛋白含量超過了5%時便很難測定序列，蛋白質(zhì)制劑中的雜質(zhì)蛋白含量達(dá)到一定程度時，一級結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果將是沒有意義的。蛋白質(zhì)的分子量測定：這個數(shù)據(jù)對于確定蛋白質(zhì)肽鏈的組成是很重

13、要的。測定分子量的目的主要是為了估計序列工作量的大小。對分子量測定的準(zhǔn)確性要求不高，誤差在10%左右就足夠了。常用的方法有：凝膠層析法：包括“凝膠柱層析測定法”和“凝膠薄板層析法”。第一版103-106頁SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：第一版106頁；第二版57-59頁沉降分析法：包括“沉降速度法”和“沉降平衡法”第一版101-103頁確定組成蛋白質(zhì)的多肽鏈（亞基）的數(shù)目、種類和大?。簛喕臄?shù)目：采取亞基拆離處理之后，如果蛋白質(zhì)的分子量變小了，就說明蛋白質(zhì)是由多條肽鏈組成。測量每分子蛋白質(zhì)所含的N-末端殘基數(shù)目，或者SDS凝膠電泳帶的數(shù)目，都可以確定亞基的數(shù)目。拆離處理的方法根據(jù)亞基間交聯(lián)的化學(xué)鍵的

14、種類有所不同：如非共價交聯(lián)，可用高濃度變性劑（如8mol/L尿素）拆離；二硫鍵共價交聯(lián)，可用過甲酸氧化法和還原-愈甲基化法拆離。亞基的種類：組成蛋白質(zhì)的亞基可能是相同的，也可能是不同的。是否相同，可以用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法、N-末端測定法和高壓液相色譜法（HPLC）來確定。如果相同，則不需要分離處理；如果不相同，就要進(jìn)行分離和提純處理，并制備供分析用的足夠的樣品。亞基的分子量：測量方法與蛋白質(zhì)的相同。序列測定的一般步驟其工作內(nèi)容包括：1. 蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析2. 末端氨基酸的測定3. 肽鏈的專一性水解和肽段的分離純化4. 肽段的序列測定5. 由已知序列肽段建立蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)以下各

15、個步驟作詳細(xì)的介紹。第二節(jié)：蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析（pp88-92）氨基酸組成成分分析是蛋白質(zhì)化學(xué)的重要內(nèi)容之一，也是序列測定的重要組成部分。要測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成，首先要把蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸的混合物。一、蛋白質(zhì)的水解（pp88-89）常見的有：鹽酸水解法、磺酸水解法、酶水解法，以下分別介紹：1.鹽酸水解法：本法是目前應(yīng)用最廣泛的一種方法。方法較為簡便，而且，除了能夠較滿意的得到除色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）之外的所有氨基酸。方法：使用重蒸5.7mol/L鹽酸（恒沸點鹽酸），在密閉的水解管中，加熱至105110C進(jìn)行蛋白質(zhì)水解。持續(xù)2472小時。色氨酸（Trp）基本上全部被破

16、壞，必需用其它的方法測定；含硫類的半胱氨酸（Cys）可被部分破壞和氧化，最好是在氧化成穩(wěn)定的磺基丙氨酸后再測定其含量。羥基類的絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）分解緩慢。要準(zhǔn)確測定，需要做幾個水解時間的實驗，然后測定的氨基酸含量，再外推到分解時間為零時的含量。含有脂肪族的繳氨酸（Vai）和異亮氨酸（lie）由于支鏈的空間障礙，而水解緩慢，所以水解的時間要比較長。酰胺類的天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gin）在酸水解時，會脫酰胺，全部變?yōu)樘於彼幔ˋsp）和谷氨酸（Giu）。可以利用脫酰胺時放出的氨氣的數(shù)量來測定它們的總量。含硫類的甲硫氨酸（Met）鹽酸水解時，易被氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼岢?，損失2

17、0%左右?？梢杂眠@一數(shù)值來進(jìn)行校正。如果在水解時加入0.11.0%筑基乙酸和0.050.1%的苯酚，可以使絲氨酸（Ser）和酪氨酸（Tyr）回收率明顯提高，甲硫氨酸（Met）也不破壞。2. 磺酸水解法：磺酸是非氧化性強(qiáng)酸，用它來代替鹽酸有許多優(yōu)點，近年已被廣泛使用。方法：用4mol/L甲基磺酸，內(nèi)含0.2%3-呵噪基乙胺（色胺）作水解劑。在密閉的水解管中，加熱至105110C進(jìn)行蛋白質(zhì)水解。持續(xù)2472小時。優(yōu)點：水解液是中性的，水解后可以直接上機(jī)分析；本法可使色氨酸（Trp）的回收率達(dá)到90%以上；使羥基類的絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）回收率接近定量值。注意細(xì)心地用堿將水解液中和至中性

18、，這一點較難掌握；局限性：當(dāng)水解液中存在碳水化合物時，色氨酸（Trp）容易被破壞，因此對糖蛋白分子，不能用本法測定色氨酸。半胱氨酸（Cys）的測定較為復(fù)雜：待水解結(jié)束后，加入二硫蘇糖醇還原水解液中的胱氨酸，然后用過量的連四硫酸鈉氧化，得到S-磺基半胱氨酸，加以測定。酶水解法：方法：選用專一性低，水解活力高的蛋白酶水解。缺點：酶水解法最大的問題是水解不徹底，回收率不夠高。優(yōu)點：在鹽酸水解法中容易破壞的色氨酸（Try）、天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）等都可以用酶水解法直接得到。、氨基酸的分離和定量測定（pp89-90）氨基酸的分離和定量測定采用的是“氨基酸白動分析儀”。分離原理：為離子交換

19、層析，使用的柱材料為磺酸型聚苯乙烯陽離子交換樹脂。在pH2.0的條件下，全部氨基酸都能牢固地結(jié)合在樹脂上。不斷地提高pH值和離子強(qiáng)度，可以將氨基酸依次洗脫下來，從而達(dá)到分離的目的。1. 定量原理：洗脫下來的氨基酸與前三酮起反應(yīng)，生成紫色化合物（Ruheman紫），可用分光光度計于570nm比色處測定（見89頁式3-2）。僅僅脯氨酸（結(jié)構(gòu)不符合通式）例外，與前三酮反應(yīng)生成黃色化合物，于440nm處比色測定。根據(jù)每種氨基酸的峰高或峰面積，分析儀白動計算出各氨基酸摩爾濃度（作為分子）、被測蛋白質(zhì)的摩爾濃度（作為分母）和某氨基酸的殘基數(shù)（商）。目前，氨基酸白動分析儀已經(jīng)達(dá)到了很高的技術(shù)水平，充分體現(xiàn)了

20、快速、微量和白動化（見90頁，圖3-2）。、特殊氨基酸的測定（pp90-92）色氨酸（Trp）的測定：由于在鹽酸水解過程中，色氨酸幾乎全部被破壞，所以測定色氨酸要用其他的方法。除了改良的水解法之外，還有兩種光吸收法：紫外吸收法：方法：先將蛋白質(zhì)樣品溶于6mol/L鹽酸服溶液中，然后采用紫外分光光度計分別在280nm和288nm處蛋白質(zhì)溶液的光吸收值A(chǔ)280和A288。原理：由于色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）在280nm和288nm的紫外區(qū)有光吸收，因此可用完整的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行色氨酸的測量。色氨酸在280nm和288nm的摩爾消光系數(shù)分別是4815和5690;酪氨酸在280nm和288nm的

21、摩爾消光系數(shù)分別是358和1280。根據(jù)測定混合物中兩種物質(zhì)的比爾定律，可以得到（酪氨酸的摩爾濃度是已知的）：Trp摩爾濃度*A2881280卜280塑?摩爾濃度（A2804815）（A2885690）對-二甲基氨基苯甲醛法：色氨酸的呵噪核在強(qiáng)酸條件下與醛反應(yīng)生成帶色產(chǎn)物。在這個反應(yīng)中，含有色氨酸的蛋白質(zhì)的堿性水解液加入對-二甲基氨基苯甲醛的濃硫酸溶液（10%），再加入亞硝酸納溶液，經(jīng)一定時間之后，生成藍(lán)該帶色物質(zhì)的最大吸收峰位在590nm處Protein-S-（蛋白質(zhì)）ESSE（即：DTNB）Protein-SSE+ES-Protein-S-（蛋白質(zhì)）Protein-SS-Protein+E

22、S-顏色，顏色的深淺與色氨酸含量成直線關(guān)系該法已經(jīng)廣泛采用，結(jié)果可靠。2.筑基測定：測定筑基常用下列兩種比色法：（1）DTNB法：DTNB（即5.5'-二硫代雙-2-硝基苯甲酸，表達(dá)為ESSE）,與筑基反應(yīng)后生成CNT（即4-硝基-3-羥基硫酚，表達(dá)為ES-）,在412nm處的摩爾消光系數(shù)為11400L/mol.cm。荼醍測定法：荼醍與筑基有當(dāng)量加成關(guān)系，加成物在420nm左右有吸收峰，標(biāo)準(zhǔn)物和未知物在相同條件下測定，光密度增值與筑基濃度成正比。2. 二硫鍵的測定：（1）Ellman試劑法:Protein-SS-ProteinProtein-S-+2ESSEProtein-SSE+ES

23、-（pH10.5之前測得的ES-數(shù)）pH=10.53Protein-S-+3ES-（pH10.5之后測得的ES-數(shù)）二硫鍵的數(shù)目=:（pH10.5之后測得的ES嗷）-2（pH10.5之前測得的ES數(shù)）2上式中二硫鍵的數(shù)目=:（4）-2（1）2=1NTSB法：NTSB（即2-硝基-5-硫代苯磺酸，表達(dá)為ESSO3-）Protein-SS-ProteinSO32-（過量亞硫酸鹽）Protein-S-+Protein-SSO3-ESSO3-（NTSB）Protein-SSO3-+ES-二硫鍵的數(shù)目=ES啪數(shù)目。RS-在412nm處的摩爾消光系數(shù)為11400L/mol.cm。氨基的測定：測定蛋白質(zhì)和肽

24、中的氨基酸常用NTBS法、熒光胺法和鄰苯二醛-2-筑基乙醇法。三種方法的特點如下：（1）NTBS法：NTBS（即2,4,6-三硝基苯磺酸），此法比較靈敏。在溫和條件下試劑即能與伯胺定量反應(yīng)，產(chǎn)物可以用分光光度法測定。熒光胺法：熒光胺能與伯胺反應(yīng)，生成熒光團(tuán)，熒光團(tuán)可在390nm被激發(fā)，在475nm發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與伯胺濃度成正比。優(yōu)點是：游離氨的干擾極低；靈敏度可達(dá)到pmole數(shù)量級。鄰苯二醛-2-筑基乙醇法：鄰苯二醛在2-筑基乙醇存在的條件下，與伯胺生成強(qiáng)熒光物質(zhì)，可在340nm被激發(fā)，在455nm測量熒光。優(yōu)點是：在水緩沖液中可溶而且穩(wěn)定；靈敏度比熒光胺還高5-10倍。第三節(jié)：末端氨基酸

25、的測定（pp92-98）末端分析可分為N末端的測定和C末端的測定兩個方面。一、N末端的測定（pp92-96）它具有a-氨基，N末端引入某種標(biāo)記基團(tuán),獲得氨基酸混合物。然后分組成蛋白質(zhì)每條多肽鏈的第一個氨基酸與內(nèi)部的氨基酸不同，這正是進(jìn)行末端氨基酸測定的基礎(chǔ)。N末端測定法的共同原理是在這些基團(tuán)或具有顏色，或具有熒光、紫外吸收等特性。酸水解多肽，離鑒定具有這些基團(tuán)的氨基酸衍生物。pH8.0-9.0,室溫）與肽這個鍵結(jié)合很牢固，經(jīng)鹽1.DNFB法：（傳統(tǒng)的方法）原理：DNFB（即2,4-二硝基氟苯）在溫和的條件下（鏈的N端氨基作用，形成二硝基肽鏈（簡稱DNP-Peptide酸水解仍然不斷裂，水解后形

26、成的DNP-氨基酸（黃色），可以用乙酬抽提出來，進(jìn)行層析，根據(jù)斑點的位置作定性鑒定；或用溫?zé)岬?%NaHCO3洗脫后，測360nm波長的吸收作定量測定。反應(yīng)過程：H2N-Peptide-COOHDNFB，室溫，pH8-9DNP-HN-Peptide-COOH+HFH+水解，105CDNP-氨基酸+氨基酸（2tn）DNP-氨基酸見光易分解，所以操作應(yīng)在暗處進(jìn)行；DNFB不僅與N端的a-氨基起反應(yīng)，也與側(cè)鏈上的&-氨基、筑基、酚羥基和咪哇基反應(yīng)，但因水解產(chǎn)物極性較強(qiáng)，不被乙酬抽提，故不干擾N端測定。有些DNP-氨基酸：a-DNP-His、DNP-Arg、DNP-Cys、O-DNP-Tyr等

27、均溶于水，不被乙酬抽提，故應(yīng)將水蒸干，分別鑒定。如果檢測不出DNP-氨基酸，則可能有以下原因： 被分析的肽鏈N端是封閉的，例如：焦谷氨酰基、乙酰基等；N端為繳氨酸（Vai）和異亮氨酸（Ile），其肽鍵耐酸，要延長水解；N端為脯氨酸（Pro）和甘氨酸（Gly），兩者易破壞，需縮短水解。丹磺酰氯分析法：（廣泛使用的方法）原理和方法：二甲基荼磺酰氯（DNS-CL）是一種熒光試劑，能專一地與N端的a-氨基起反應(yīng)，生成氨磺酰衍生物DNS-Peptide，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液移至水解管中，真空干燥，然后加鹽酸水解18小時。經(jīng)鹽酸水解后，得到DNS-氨基酸（強(qiáng)烈熒光）和其它的游離氨基酸，水解液真空干燥后用無

28、水乙醇溶解，可以直接用電泳或?qū)游龇ㄨb定，（參見圖3-3）。反應(yīng)過程：H2N-Peptide-COOHDNS-Cl,pH8-9DNS-HN-Peptide-COOH+HClH+,105C,18hDNS-氨基酸+氨基酸（2tn）優(yōu)點：靈敏度高，比二硝基氟苯高100倍，檢測靈敏度可達(dá)10-9-10-10摩爾；操作簡便，水解產(chǎn)物不需提取，直接電泳或?qū)游觯浑m然組氨酸（His）的咪哇基、半胱氨酸（Cyr）的筑基、酪氨酸（Tyr）的酚基和£-氨基酸也能和試劑反應(yīng)，但不會影響測定結(jié)果。其他的N末端測定方法有：異硫氧酸苯酯法、DABITC法等，將在第五節(jié)介紹。3.焦谷氨酰殘基的降解：谷氨酰胺（Gln）

29、發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成焦谷酰胺環(huán)化衍生物是封閉N末端最常見的情況之一（見95頁，式3-14）。目前降解N末端焦谷酰胺殘基有兩種方法：酶解法：用市售的焦谷酰胺肽酶，可以將焦谷酰胺從肽鏈上酶解下來。化學(xué)降解法：（96頁式3-16是錯誤的）寫信問過再講。C末端的測定（pp96-98）1.腓解法：此法是目前測定C末端殘基最主要的方法之一。原理和方法：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與無水腓在100C反應(yīng)5-10小時之后，除了C端氨基酸之外，所有其他氨基酸都轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的氨基酸酰腓，C端氨基酸以游離氨基酸釋放出來，借助DNFB試劑和分級抽提的方法，再用層析技術(shù)可鑒定出種類和數(shù)目。反應(yīng)過程：（見96頁，式3-17）注意：肽的C端為半胱

30、氨酸（Cys）和胱氨酸時，兩者在腓解時會分解，必須先氧化或烷基化后再腓解、才可測量。2. C末端選擇性笊標(biāo)記法：反應(yīng)過程：（見97頁，圖3-4）:用醋酸酊處理多肽，形成C端酮環(huán)；在笊水存在的情況下，堿催化惡哇環(huán)消旋反應(yīng)，將笊引入惡哇環(huán)；打開惡坐酮環(huán)，重新形成C端氨基酸，此時C端氨基酸的a-碳原子已經(jīng)被笊（3H）標(biāo)記；經(jīng)水解之后，分離鑒定笊標(biāo)記的氨基酸。注意：此法不適于脯氨酸（Pro）和天冬氨酸（Asp）的測定。愈肽酶法：此法也是目前測定C末端殘基最主要的方法之一原理：愈肽酶是一類外切酶，能專一地從肽鏈的C末端開始逐個降解，釋放出游離氨基酸。釋放出來的氨基酸數(shù)目和種類隨時間變化，可用白動氨基酸分

31、析儀作定性和定量測定（見98頁，圖3-5、圖3-6）。反應(yīng)過程：（見97頁，式3-19）AA1AAn-2-AAn-1-AAn愈肽酶AA1AAn-2-AAn-1+AAn愈肽酶AA1.AAn-2+AAn-1愈肽酶優(yōu)點：一次就能從C端釋放出一至數(shù)個氨基酸殘基。（1）變性劑的使用：使用SDS或6mol/L月尿，既不影響愈肽酶的活性，又可以破壞蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)，使一級結(jié)構(gòu)不同的C末端氨基酸的釋放速度趨于相近（甘氨酸、脯氨酸很慢；亮氨酸、繳氨酸、苯丙氨酸很快）提局測定效率；同時足以抑制愈基上的正電玻璃球-peptide-AA-COOH二-P-硝基苯磷酸迭氮化合物玻璃球-peptide-AA-CON3加

32、熱玻璃球-peptide-AA-NCO酸水解玻璃球-peptide足夠的酸化：可以穩(wěn)定愈肽酶的活性，荷，加快釋放速度。選擇合適的愈肽酶：見98頁，表3-1.減數(shù)C末端測定：（僅適用于小肽）原理和反應(yīng)過程：將肽的N端固定在多孔玻璃球上；用二-P-硝基苯磷酸迭氮物處理，使-COOH轉(zhuǎn)為-CON3（酰迭氮化物）；加熱，使-CON3熱解成-NCO（異氧鹽）；產(chǎn)物經(jīng)酸水解后，使C末端殘基破壞；通過反應(yīng)前后的氨基酸的組成變化確定C末端的氨基酸。3. 還原法：是很老的方法，現(xiàn)在一般不用。第四節(jié)：肽鏈的專一性水解和肽段的分離純化（pp98-105）一、肽鏈的專一性水解（pp98-104）通常用降解法測肽鏈的氨

33、基酸序列，一次只能連續(xù)降解法測序，一次最多能測20多個殘基。所以必須將大肽先裂解為小10個殘基；用手工方肽，然后再分別測定各個肽段的序列，最后才能解讀出整個蛋白質(zhì)的氨基酸序列。方法分為兩類：化學(xué)法裂解和酶法裂解。裂解前必須注意三個問題：使用酶法時，需考慮：是讓蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下裂解？還是先變性，后裂解？裂解時，是否想完整保留二硫鍵？在裂解和提純的過程中，是否出現(xiàn)了原來并不存在的二硫鍵？、蛋白質(zhì)的化學(xué)法裂解特點：化學(xué)法裂解的肽段一般較大，適合于用白動序列分析儀測定，同時有利于肽段的吻合，特別適合分析分子量較大的蛋白質(zhì)。1.漠化氧（CNBr）裂解：原理：漠化氧能與蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸（Met）R側(cè)鏈

34、中的硫酬基反應(yīng)，生成漠化亞氨內(nèi)酯。此產(chǎn)物與水進(jìn)一步反應(yīng)，將肽鍵斷裂。N端一側(cè)的C端成為高絲氨酸內(nèi)酯，C端一側(cè)的N端不改變。因為蛋白質(zhì)一般含甲硫氨酸較少，所以能夠得到較大的肽段。反應(yīng)過程：反應(yīng)時間24小時-Met-NH-AA-BrC三N-Br-+Met-C三N-NH-AA-漠化亞氨內(nèi)酯=N+H-AA-+CH3-S-C三NH2O,H+高絲氨酸內(nèi)酯H2O,OH+H3N-AA-（右側(cè)小肽的N端）+Br高絲氨酸左側(cè)小肽的端）方法說明：防止氧化：甲硫氨酸如果被氧化為硯和亞硯，則不能發(fā)生裂解反應(yīng)，所以整個反應(yīng)要在氮氣容器中進(jìn)行；漠化氧對甲硫氨酸要過量50-100倍（摩爾比）；反應(yīng)時間24小時；CNBr裂解采

35、用酸性條件，可引起Asp-Pro（天冬-脯）鍵的斷裂，如果某一序列含有這個鍵，所得的肽段數(shù)目就比根據(jù)甲硫氨酸預(yù)計的數(shù)目多。當(dāng)漠化氧裂解含Met-X肽鍵時，X的性質(zhì)可以影響裂解速度；當(dāng)X為羥基類絲氨酸或蘇氨酸時，可以使甲硫氨酸變成高絲氨酸，因而不能裂解肽鍵（見100頁，圖3-7），解決方法為增加CNBr的使用量。優(yōu)點：產(chǎn)率高（85%）、專一性強(qiáng)、切點少，使用廣泛。2. BNPS-Skatole法：原理：BNPS-Skatole是一種溫和的氧化劑和漠化劑，可以對芳香族的色氨酸（Trp）有專一性裂解能力。它可以色氨酸的殘基的右側(cè)（C末端一側(cè)）裂解肽鍵。因為蛋白質(zhì)一般含色氨酸極少，所以能夠得到大的肽段

36、，成為很有用的裂解方法。反應(yīng)過程：（見101頁，圖3-8）由于試劑對光敏感，不穩(wěn)定，所以反應(yīng)要在暗處進(jìn)行；甲硫氨酸（Met）可以與試劑發(fā)生作用，反應(yīng)結(jié)束后可以使用筑基乙醇消除影響；酪氨酸（Tyr）也可以與試劑發(fā)生反應(yīng)，如果加入過量的酪氨酸則可以這種反應(yīng)的發(fā)生。3. 亞碘?；郊姿崃呀夥ǎ涸砗头椒ǎ捍嗽噭┛稍谙喈?dāng)溫和的條件下裂解Trp-X（色-X）肽鍵，其機(jī)理也是氧化呵噪環(huán)。產(chǎn)率高達(dá)70-100%。蛋白質(zhì)溶解于4mol/L鹽酸月瓜（用80%醋酸液配置）中，再加適量甲酚。于室溫、暗處反應(yīng)24小時。過量試劑用DTT破壞。反應(yīng)過程：（見101頁，圖3-9）要用純化的亞碘?；郊姿幔驗殡s質(zhì)碘?；郊?/p>

37、酸可以在His-X鍵上裂解。甲酚的功能就是清除殘余的碘酰基苯甲酸，改善裂解的選擇性。4. X-Cys（X-半胱）鍵的裂解：有兩種試劑可以在半胱氨酸N端側(cè)專一性裂解肽鏈，裂解產(chǎn)率90大于:（1）NTCB,即2-硝基-5-硫氧苯甲酸；Cyssor,即（2-甲基）-N-1-苯磺酰胺。反應(yīng)過程見102頁，圖3-10.羥胺裂解法：羥胺能夠?qū)Ｒ恍粤呀釧sn-Gly（天冬酰胺-甘氨酸）之間的肽鍵，因為出現(xiàn)的幾率很低，所以此法降解的肽段都很大，對分子量大的蛋白質(zhì)測序十分有用。原理：通過羥胺作用，先形成琥珀酰亞胺環(huán)狀物，最后導(dǎo)致Asn-Gly鍵裂解。方法：（1）先制備含6mol/L服的2mpl/L羥胺溶液，用N

38、aOH調(diào)pH至9.0；加入蛋白質(zhì)（濃度為4-5mg/ml）；反應(yīng)條件為：pH9.0、45C、4-5小時；力口0.1體積的醋酸終止反應(yīng)。反應(yīng)過程：4. Peptide-Asn-Gly-PeptidePeptide-環(huán)亞酰胺-Gly-PeptideNH2OH（羥胺）Peptide-a-Asp-羥胺+Gly-PeptidePeptide-3-Asp-羥胺Asp-Pro鍵的裂解（部分酸水解法）：老方法，專一性不好。、蛋白質(zhì)的酶法裂解1.優(yōu)點：專一性強(qiáng)；降解后的肽段容易純化；裂解產(chǎn)率較高；副反應(yīng)少，在酸水解中容易被破壞的Gln、Asn和Trp等在酶解時不受影響。影響因素：合適的pH值；合適的反應(yīng)溫度；恰

39、當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)與酶的比率；選擇相應(yīng)的反應(yīng)時間；待裂解蛋白質(zhì)的物理狀態(tài)。注意實驗前做好預(yù)實驗。2. 常用的內(nèi)切酶：胰蛋白酶：高度專一性，只切堿性的Lys（賴）和Arg（精）的右側(cè)，常用；胰凝乳蛋白酶：專一性寬，芳香族氨基酸的右側(cè)；胃蛋白酶：專一性更寬，芳香族氨基酸和Leu（亮）；枯草桿菌蛋白酶：專一性差，裂解出足夠小的肽段；木瓜蛋白酶：專一性差，但對Lys（賴）和Arg（精）的右側(cè)敏感；嗜熱菌蛋白酶：耐熱，所有疏水氨基酸的的左側(cè)，很常用； Glu蛋白酶（谷右） Arg蛋白酶（精右）Lys蛋白酶（半左）Pro蛋白酶（脯右）新近發(fā)現(xiàn)的高專一性蛋白水解酶：:來白金黃色葡萄球菌，又稱（V8蛋白水解酶）:又稱

40、Clostripain,已廣泛用于蛋白質(zhì)序列分析;:來白A.mellea菌，來白小羊的腎細(xì)胞。、肽段的分離純化及純度鑒定（pp104-105）、肽段的分離純化原因：肽鍵裂解后得到各種不同大小肽段的混合物，在序列測定之前一定要分離歸類，每種肽段都要純化（工作量非常大）。原理：根據(jù)肽段的理化特征，包括：分子的大小、電荷、極性、溶解度、以及與特殊的共價鍵和非共價鍵結(jié)合等特性進(jìn)行分離和純化。方法：凝膠過濾法、離子交換法、薄層層析法、薄層電泳法、毛細(xì)管電泳法等。對角線法：（一種獨特的傳統(tǒng)方法）不改變肽段性質(zhì)：在雙向電泳或者雙向?qū)游鲋校魞蓚€向上的電泳或?qū)游龆荚谙嗤臈l件下完成，結(jié)果會得到對角線圖譜，即所

41、有的組分（肽段）的斑點都分布在一條對角線上。改變某些肽段的性質(zhì)：如果有些肽段在第一向和第二向的遷移率不同，則它們就不會分布在對角線上，因此，可以被表征、分離。要使肽段在兩向上的遷移率不同，就要在第一向分離后，改變某個肽段的性質(zhì)。被改變性質(zhì)的肽段在第二向分離后，就可以離開對角線。舉例：如果某個肽段含有二硫鍵，則可以在第一向之后，將二硫鍵還原，這時含有二硫鍵的肽段會裂解為兩個更小的肽段，再進(jìn)行第二向分離，它們就會離開對角線，得到分離。適用范圍：含筑基、甲硫氨酸、賴氨酸的肽段，和胰蛋白酶降解后的C端肽段。2.高壓液相色譜法：（廣泛使用的方法）特點：（1）收率高：一般大于90%，有時高達(dá)100%;分離

42、快速：傳統(tǒng)方法要幾天完成的任務(wù)，HPLC只需要1小時；靈敏度高、分辨率高：很微量（10ng）的肽段也能分離；、肽段定量檢測方法：1. 1.紫外吸收法：肽鍵在200-210nm處有強(qiáng)吸收，是最方便的定量方法；前三酮比色法：570nm處比色。常用，但靈敏度低；鄰苯二醛熒光法：激發(fā)波長340nm,發(fā)射波長455nmi靈敏度高出前三酮法1-2個數(shù)量級。（紫外線：w400nm;可見光：400nm）、肽段純度鑒定：在肽混合物分離過程中，常常要鑒定個別分離物的純度，以便決定是否需要進(jìn)一步提純。雖然層析和電泳中只有一條帶（一個斑）即可能是純肽。但是一般說，鑒定肽是否純的唯一標(biāo)準(zhǔn)是：純肽只有一個N端。這是因為，

43、如果有二硫鍵的存在，可能使兩條肽段連在一起，雖然層析和電泳時只有一條帶或一個斑；但是出現(xiàn)了2個N端，這表明不是純肽。第五節(jié)：肽段的序列測定（pp105-111）一、手工序列測定技術(shù)（pp105-110）包括：化學(xué)法、酶學(xué)法、Edman化學(xué)降解法：迄今仍然是最基本和有效的方法。原理：蛋白質(zhì)或多肽的白由a-氨基與異硫氧酸苯酯（PITC）耦聯(lián)之后，與其緊鄰1. 的第二個氨基酸殘基的鍵合力大大減弱，很易斷裂，所以在無水酸作用下，僅切下白由a-氨基的殘基，切下的氨基酸被抽提，并被鑒定。當(dāng)切下N端這個殘基后，緊鄰的那個殘基（第二個）便暴露出來，成為了新的白由a-氨基酸，又可與PITC進(jìn)行耦聯(lián)反應(yīng)，再切下第

44、二個殘基，以此循環(huán)。至多可以測定60-70個殘基。反應(yīng)過程：（見106頁，式3-13）提前去教室畫圖耦聯(lián)反應(yīng)：肽的白由a-氨基與異硫氧酸苯酯（PITC）在堿性條件下發(fā)生耦聯(lián)反應(yīng)，生成異硫氧酸苯酯肽（PTC-肽）。斷裂反應(yīng)：在強(qiáng)酸作用下，PTC-肽的近N端肽鍵斷裂，產(chǎn)生2-苯胺基-5-嚷哇咻酮衍生物（PTZ）,同時形成少了一個氨基酸的新肽，新肽的N端仍然是白由的，可以進(jìn)一步與PITC反應(yīng)，進(jìn)行第二次降解。2. 轉(zhuǎn)化反應(yīng)：斷裂產(chǎn)物PTZ不穩(wěn)定，為了隨后的N端氨基酸分析測定，將PTZ轉(zhuǎn)化為3-苯基-2-乙內(nèi)酰月尿（PTH-AA）。分析方法：每一次循環(huán)之后，可用乙酸乙酯抽提生成的PTH-AA。PTH-

45、AA非常穩(wěn)定，抽提后可以用薄層層析、氣相色譜、高壓液相色譜法、回水解法（指的是：用酸水解PTH-AA,使其轉(zhuǎn)化為游離氨基酸，再用氨基酸分析儀分析）分析，確定這一輪是某種氨基酸。反應(yīng)的限制因素：關(guān)鍵是肽轉(zhuǎn)變成PTC-肽，及隨后降解反應(yīng)的產(chǎn)率。如果這兩步的總產(chǎn)率是95%，則可以連續(xù)測定15個殘基（總產(chǎn)率約45%）;如果這兩步的總產(chǎn)率是99%,則可以連續(xù)測定60-70個殘基（總產(chǎn)率約50%）。、減數(shù)Edman序列分析法：這是一種改良Edman降解技術(shù)。每一種反應(yīng)階段之后，將未反應(yīng)的肽水解，并進(jìn)行氨基酸組成的全分析，可用氨基酸白動分析儀或紙電泳的方法。依據(jù)氨基酸減少的情況，可以推斷出N端氨基酸的排列順

46、序。對于小肽來說，此法更快、更準(zhǔn)確，只要一臺氨基酸白動分析儀就夠了。少于10-15個殘基的小肽可用本法來測定。、DNS-Edman序列分析法：這也是一種改良Edman降解技術(shù)。此法將高靈敏度的丹磺酰氯技術(shù)（DNS-Cl,參見94頁）與能連續(xù)降解的Edman降解反應(yīng)有機(jī)地結(jié)合起來。原理：DNS的作用：降解、標(biāo)定、檢測末端氨基酸：由于水解后的生成物是帶熒光的DNS-AA，其檢出的靈敏度比Edman法高出一個數(shù)量級。PITC的作用：降解、清掃剩余的末端氨基酸，為下一步的測序清除障礙。缺點：在與DNS-Cl的反應(yīng)中，谷氨酰胺（Gin）和天冬酰胺（Asn）誤讀為谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），而且

47、不能檢出色氨酸（Trp）。反應(yīng)過程（見107頁，式3-14）：提前去教室畫圖、DABITC/PITC雙耦合法：一種改良Edman法，靈敏度非常高。原理：與DNS-Edman法類似。（1）DABITC的作用：降解、標(biāo)定、檢測末端氨基酸。層析出的DABTH-AA，經(jīng)鹽酸蒸氣熏，能顯示紅色的斑點，而雜質(zhì)和試劑的反應(yīng)物顯藍(lán)色或紫色斑點，極大地提高靈敏度，只需微量的樣品即可，靈敏度達(dá)到pmol的數(shù)量級。PITC的作用：降解、清掃剩余的末端氨基酸，為下一步的測序清除障礙。由于DABITC（4-N,N-二甲基氨基偶氮苯-4-異硫氧酸酯）耦合的反應(yīng)產(chǎn)率低，一般不到50%，故用PITC（異硫氧酸苯酯）作再次耦合

48、、降解，其到清掃剩余的末端氨基酸，提高反應(yīng)產(chǎn)率的作用。反應(yīng)過程：見108頁式3-21（DABITC的作用）。、酶學(xué)降解測定肽序列（了解一下，實際中困難很多）1.氨肽酶法：氨肽酶是專一性從N端逐個降解多肽的一類外肽酶。種類很多。2.短肽酶法：特點是能從C端專一性逐個降解多肽，和化學(xué)法及氨肽酶法不同酶法：每隔兩個殘基切一次。分二肽氨肽酶和二肽短肽酶兩類。、白動序列分析（pp110-111）有三類蛋白質(zhì)序列儀：液相序列儀、固相序列儀、氣相序列儀。基本原理相同，都是采用Edman反應(yīng)，逐個降解N端殘基，然后白動檢出殘基性質(zhì)和數(shù)量，最后白動報告肽鏈的氨基酸序列。.液相序列儀：優(yōu)點：收率高，可達(dá)97%;可

49、以連續(xù)測定20-50殘基。缺點：不適合于小肽的測定（易從反應(yīng)杯中洗出）。.固相序列儀：優(yōu)點：可以測定小肽；可以測定疏水性肽。缺點：收率低（結(jié)合到了固相上），有時僅20-30%。1. 氣（液固）相序列儀：靈敏度高，可以測定5pmol水平樣品；試劑和溶劑消耗低，約為液相的1/10;速度快，最多一次可以測定55個殘基；收率高，重復(fù)收率可以達(dá)到98%。缺點：非常昂貴，非一般實驗室所能設(shè)置。弟/、:由已知序列肽段建立蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)（pp111-113）-、重疊肽（接頭肽）（pp111-111）尋找重疊肽，是S.Moore基本戰(zhàn)略的關(guān)鍵之一。1.S.Moore基本戰(zhàn)略的原理：必須使用至少兩套切肽鏈的方法，

50、得到兩套以上的肽段氨基酸排列順序。而且，每套斷鏈的方法沒有相同的切點，這樣就出現(xiàn)了下圖的情況。因此，可以借助重疊肽，建立蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)。C（共7C段）原始肽鏈N第123-C（共4段）_套肽N第套肽N一1'2'3'重疊肽的概念：第一套肽段較小，有數(shù)個肽段（1,2-n）正好跨過了第二套肽的相應(yīng)的缺口（1',2'-n'）。在第一套肽段中，那些可以跨過第二套肽段缺口的片段被稱為重疊肽，通過對比氨基酸殘基排列順序的方法，它們所具有將第二套肽正確對接和排列的功能。二硫鍵位置的確定（pp112-112）原理：我們知道，二硫鍵是構(gòu)成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)的主要

51、作用力之一。它在一級結(jié)構(gòu)中的物質(zhì)基礎(chǔ)是半胱氨酸（Cys）。為了測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，肽鏈中的二硫鍵都被還原成為半胱氨酸，并用烷基化法保護(hù)。在一級結(jié)構(gòu)測定完畢之后，就可以確定二硫鍵的位置了。方法：酶切法：用酶來水解原蛋白質(zhì)，可以保留二硫鍵的完整性。再找出含有二硫鍵的肽段，將這個肽的二硫鍵拆開，分別測定拆開后的兩條肽段的序列，將這兩條肽段的氨基酸殘基排列順序與原來的一級結(jié)構(gòu)對比，就能找出相應(yīng)的二硫鍵的位置。14C-碘乙酰胺封閉法：若二硫鍵在一條肽鏈中存在，而且該肽鏈內(nèi)還有另一個半胱氨酸（Cys），則在二硫鍵未被拆開之前，將獨立的半胱氨酸用14C-碘乙酰胺封閉和標(biāo)記。這樣就可以確定那兩個Cys組成了二硫鍵。雙酶切法：如果一條肽鏈內(nèi)含有兩個二硫鍵，用胰蛋白酶水解又得不到含有一個二硫鍵的肽段時，可以進(jìn)一步用胰凝乳蛋白酶水解，或用其它方法水解，直到得到含有一個二硫鍵的肽段，然后按前述的方法確定二硫鍵的位置。三、酰胺基位置的確定（pp112-112）原理：在蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成分析時（第二節(jié)、一、蛋白質(zhì)的水解），如果發(fā)現(xiàn)有酰胺基存在，則在本階段一級結(jié)構(gòu)的研究中就要確定酰胺鍵的確切的位置。多肽鏈中的側(cè)鏈和C端的愈基（即Glx或Asx）:有可能以-COOH形式存在（谷氨酸Glu或者天冬氨酸Asp），也可能以-CONH3形式存在（谷氨酰胺Gln或者天冬酰胺Asn）。一般來講，-