菌懸液與菌片的制備

1、菌懸液與菌片的制備2.1.1.2.1 適用范圍 制備消毒劑殺菌試驗用細菌懸液與菌片， 以供消毒劑殺菌試驗時使用。2.1.1.2.2 試驗器材（1）菌種: 金黃色葡萄球菌 ATCC 6538、銅綠假單胞菌 ATCC 15442、 大腸桿菌8099、枯草桿菌黑色變種ATCC9372、龜分枝桿菌膿腫亞種ATCC93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌 ATCC1023、黑曲霉菌ATCC16404在上述規(guī)定的菌株基礎(chǔ)上，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗 特殊需要，還可增選其他菌株。（2）有機干擾物：見附錄 A。（ 3）磷酸鹽緩沖液：見附錄 A。 （4）無菌蒸餾水。（ 5）稀釋液：見附錄 A。（6）細菌培養(yǎng)

2、基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA，胰蛋白胨大豆 肉湯培養(yǎng)基（TSB等，見附錄A。（ 7）革蘭染色液：見附錄 A。（ 8）芽孢染色液：見附錄 A。（ 9 ）恒溫水浴箱。（ 10）玻璃漏斗。（11）刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛細吸管。（12）數(shù)字可調(diào)移液器（10卩l(xiāng) , 20卩l(xiāng) , 100卩l(xiāng) , 200卩l(xiāng) , 1000卩l(xiāng) ） 及配套用一次性塑料吸頭。（13）離心機。（14）電動混合器（15）濁度計。2.1.1.2.3 細菌懸液制備程序（1）細菌繁殖體懸液的制備1）取凍干菌種管，在無菌操作下打開，以毛細吸管加入適量營養(yǎng)肉湯，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0

3、ml10.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37C培養(yǎng)18h24h。用接種 環(huán)取第 1 代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 37C培養(yǎng)18h24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營 養(yǎng)瓊脂斜面，于37C培養(yǎng)18h24h,即為第3代培養(yǎng)物。2）取菌種第 3 代 14 代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（ 18h 24h），用5.0ml吸管吸取3.0 ml5.0ml稀釋液加入斜面試管內(nèi)， 反復吹吸，洗下菌苔。隨后，用 5.0ml 吸管將洗液移至另一無菌試管 中，用電動混合器混合（振蕩）20s，或在手掌上振敲80次，以使細 菌懸浮均勻。3）初步制成的菌懸液，先用細

4、菌濃度比濁測定法粗測其含菌濃度， 然后以稀釋液稀釋至所需使用的濃度。4）細菌繁殖體懸液應(yīng)保存在4C冰箱內(nèi)備用。應(yīng)當天使用不得過夜。5）懷疑有污染時，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗等法進行鑒（2）細菌芽孢懸液的制備1）取凍干菌種管，在無菌操作下打開，以毛細吸管吸加適量營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含 5 ml10ml營養(yǎng) 肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37C培養(yǎng)18h24h。用接 種環(huán)取第 1 代培養(yǎng)的菌懸液， 劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上， 于 37C培養(yǎng)18h24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營 養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于37C培養(yǎng)18h24h,即為第3代培養(yǎng)

5、物。2）用 10.0ml 吸管吸取 5.0 ml10.0ml 第 3 代5代的 18h24h 營 養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物， 接種于羅氏瓶中營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面， 將其搖動使菌 液布滿營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的表面， 再將多余肉湯培養(yǎng)物吸出， 將羅氏瓶 置于37C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)5d7d。3）用接種環(huán)取菌樣少許涂于玻片上， 固定后以改良芽孢染色法染色， 并在顯微鏡（油鏡）下進行鏡檢。當芽孢形成率達 95% 以上時，即 可進行以下處理。否則，應(yīng)繼續(xù)在室溫下放置一定時間，直至達到上 述芽孢形成率后再進行以下處理。改良芽孢染色法：用接種環(huán)取菌樣涂布于玻片上，待自然干燥。而 后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。 將涂片放入平皿內(nèi)，

6、片上放兩 層濾紙，滴加足量的5.0%孔雀綠水溶液。將平皿蓋好，放 54C 56C條件下，加熱30min。取出，去濾紙，用自來水沖洗殘留孔雀綠溶液。加0.5%沙黃水溶液，染1min。水洗，待干后鏡檢。芽孢 呈綠色，菌體呈紅色。4）羅氏瓶培養(yǎng)物， 用 10.0ml 吸管加 10.0ml 無菌蒸餾水于每一羅氏瓶中，以 L 棒輕輕推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液，再向瓶內(nèi) 吸加 5.0ml 無菌蒸餾水，重復洗菌一遍。將第一和第二批洗下的菌 懸液集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶中，振搖5mi n,打碎菌塊，使成均勻的芽孢懸液。5）必要時，將盛裝菌懸液的三角燒瓶置 45C水浴中24h，使菌自溶 斷鏈,分散

7、成單個芽孢。6）用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液,清除其中的瓊脂凝塊。7） 將過濾后的芽孢懸液,置無菌離心管內(nèi),以3000 r/min 速度離 心 30min 。棄上清液,加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。再離心和重新 懸浮清洗,先后共 3 遍。8）將洗凈的芽孢懸浮于三角燒瓶內(nèi)蒸餾水中, 并加入適量小玻璃珠。9）將芽孢液放于80C水浴中10min （或60C, 30min）,以殺滅殘 余的細菌繁殖體。待冷至室溫后，保存于 4C冰箱中備用。有效使用 期為半年。10）芽孢懸液在使用時,應(yīng)先進行活菌培養(yǎng)計數(shù)。11）懷疑有雜菌污染時,應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗等法進 行鑒定。2.1.1.2.4 菌片的制備

8、程序（1）消毒試驗中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。載體應(yīng)根 據(jù)消毒對象選擇，常用的有金屬、玻璃、濾紙、線、棉布等。根據(jù)其 特點選擇適宜材料載體作為代表。載體可以為方形，大小為10mM 10mm當以金屬片為載體時，因方形金屬載體在振敲時可將 玻璃試管撞碎，故改用 12mm 直徑圓形金屬片（厚 0.5mm）。（2）所用載體（除濾紙片外）于染菌前，應(yīng)進行脫脂處理。脫脂方法如下：將載體放在含洗滌劑的水中煮沸 30 min ;以自來水洗 凈；用蒸餾水煮沸10min ;用蒸餾水漂洗至pH呈中性；晾干、 熨平備用。（3）布片用白平紋棉布制作。在剪開前，先將脫脂的布塊按載體規(guī) 定的大小，抽去邊緣一周的經(jīng)

9、緯紗各一根，再按抽紗痕剪開。此法制 成的載體大小一致，且無毛邊。金屬片以不銹鋼制作，紙片以新華濾 紙制作。（4）載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，使用滴染法染菌。染菌用菌懸液：使用TSB營養(yǎng)肉湯配制。細菌繁殖體，可直接使用經(jīng) 18h24h培養(yǎng)的斜面培養(yǎng)物，細菌芽孢可使用4C冰箱貯存液。含菌 量約為1X 108cfu/ml5x108cfu/mI ,可使用濁度計調(diào)整菌液濃度。 滴染法染菌時，將經(jīng)滅菌的載體片平鋪于無菌平皿內(nèi)， 逐片滴加菌液。 菌液滴加量每片為10卩I。用10卩I移液器接滅菌塑料吸頭滴染菌液， 并用接種環(huán)涂勻整個載體表面。滴染菌液后，染菌載體可置37C溫箱內(nèi)干燥（約20min30min）,或置室溫下自然陰干后再使用。（5）每個菌片的回收菌數(shù)，按活菌培養(yǎng)計數(shù)所得結(jié)果，應(yīng)為5X 105 cfu/ 片5X 106 Cfu/ 片。2.1.1.2.5 注意事項 （1）用濁度計測定的菌懸液濃度，只用于在滴染菌片時對菌懸液稀 釋度的估計。 作為菌懸液含菌濃度或菌片染菌量的正式報告 （如殺菌 試驗中陽性對照組菌懸液或菌片所含菌量） ，必須以活菌培養(yǎng)計數(shù)的 實測結(jié)果為準，不得使用根據(jù)比濁法判定的估計值。（ 2）滴染時，菌液滴加量不宜過多，避免流散影響染菌的準確性。（3）細菌繁殖體在烤干過程中，可引起部分死亡，如銅綠假單胞菌 在37C干燥過程中，滴度最高可下降1個對數(shù)值