藥物MTT實驗步驟(優(yōu)選)

1、藥物MTT實驗步驟（貼壁細(xì)胞）-個人改進版1. 邊緣孔用無菌PBS充填。收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為50000個/ml , 每孔加入100ul細(xì)胞懸液（每孔5000個細(xì)胞）。注：每次加入細(xì)胞都使槍頭貼著孔底邊緣 （最好相同位置），緩慢加入100ul 細(xì)胞懸液?？准尤腠樞颍嚎蓮纳系较?，從左到右依次加入。為了保證細(xì)胞密度均勻，最好每加3-5列細(xì)胞混勻一下細(xì)胞懸液，避免因 重力沉降導(dǎo)致細(xì)胞密度不均。每塊96孔板加完細(xì)胞后，應(yīng)拿起板子 前后左右水平搖晃幾下（勿旋轉(zhuǎn)搖 晃），使細(xì)胞均勻分散。一般設(shè)6個復(fù)孔（B-G行），對照孔非常重要，且變異大，故設(shè) 2列（2, 3列為對照孔），4-10或4-11列

2、為給藥孔。邊緣孔用無菌PBS充填，2-11列均可加入細(xì)胞。因為要設(shè)置調(diào)零孔（即 不加細(xì)胞孔），所以可將第11列設(shè)為調(diào)零孔，也可將第12列的無菌PBS孔在第 2天加藥時改為調(diào)零孔。2. 細(xì)胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待貼壁后第二天給藥（通常前一天下午或晚上鋪板，第2天上午給藥）。給藥方法：先配好藥（用EP管配好藥），再拿出96孔板， 棄去原有培養(yǎng)液（可不用PBS洗，太麻煩了），加入藥物。注：MTTto藥時都是先配藥再棄去原培養(yǎng)液，最后加入藥物。切勿先棄去原有 培養(yǎng)液再配藥，因為配藥一般要花較長時間，若先棄去培養(yǎng)液再配藥會導(dǎo)致細(xì)胞 無營養(yǎng)液體而死亡。藥物是用母液溶于無血清培養(yǎng)基配成工作液 ，事先算好對照孔，

3、藥物孔， 調(diào)零孔如何配制，如何設(shè)置加藥順序。一般越靠中央的孔變異越小，故最重要的 給藥孔一般放在最中間，次要孔放邊緣，調(diào)零孔可用第11或12列。如果某個給藥孔需加入2種藥物，一般需要一種藥物先預(yù)處理1-2h （預(yù) 處理藥物可用Ep管配好后再分別加入各孔），1-2h再加入另一種藥物（直接加 入各孔）。3. 細(xì)胞放入培養(yǎng)箱 培養(yǎng)24h （或其他指定時間）。4. 藥物作用結(jié)束后，每孔加入20ul-MTT （避光）（5mg/ml），培養(yǎng)3-4h。若藥 物能與MTT反應(yīng)，可先棄去原培養(yǎng)液，再加入含 MTT的培養(yǎng)液（無血清培養(yǎng)液： MTT=5 1 配制）。注：MTT使用前預(yù)先解凍。MTT對光敏感，故一般保存于負(fù)20E，配好 5mg/mlMTT后我習(xí)慣分裝于EP管中。5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入 150ul-DMSO （DMS可預(yù)先算好 所需體積加入15ml離心管中），37C溫箱孵育10分鐘或搖床低速振蕩10分鐘。 之后用酶標(biāo)儀檢測OD-490nm （也有測570nm的）各孔的吸光度（A）值。6. 同時設(shè)置調(diào)零孔（無血清培養(yǎng)基,MTT, DMSO,對照孔（細(xì)胞，最大濃度的藥物溶解介質(zhì)，無血清培養(yǎng)基,MTT, DMSO 。7. 細(xì)胞活力(cell viability):細(xì)胞活力(cell viability of contr