發(fā)酵工程的研究狀況和進(jìn)展

1、1發(fā)酵工程的研究狀況和進(jìn)展發(fā)酵工程的研究狀況和進(jìn)展陳陳 堅(jiān)堅(jiān)江南大學(xué)江南大學(xué)2發(fā)酵工程的研究狀況發(fā)酵工程的研究狀況3生物質(zhì)原料化學(xué)品化學(xué)品精細(xì)化學(xué)品精細(xì)化學(xué)品大宗化學(xué)品大宗化學(xué)品食品添加劑食品添加劑生物塑料生物塑料溶劑溶劑酚類酚類粘合劑粘合劑脂肪酸脂肪酸碳黑、顏料碳黑、顏料燃料、香料、墨水燃料、香料、墨水洗滌劑洗滌劑生物能源生物能源生物酒精生物酒精生物柴油生物柴油甲醇甲醇?xì)錃鈿錃庹託庹託夤I(yè)生物技術(shù)主要部分工業(yè)生物技術(shù)主要部分-發(fā)酵工程發(fā)酵工程4發(fā)酵：生物發(fā)酵：生物反應(yīng)過程反應(yīng)過程上游上游加工過程加工過程加工過程加工過程下游下游成本經(jīng)濟(jì)學(xué)成本經(jīng)濟(jì)學(xué)原料原料的生物的生物具有具有應(yīng)用價(jià)值應(yīng)用價(jià)值目

2、的產(chǎn)物目的產(chǎn)物大規(guī)模大規(guī)模工藝開發(fā)工藝開發(fā)傳統(tǒng)誘傳統(tǒng)誘變、分變、分子生物子生物學(xué)、組學(xué)、組學(xué)學(xué)發(fā)酵工程發(fā)酵工程廣義的概念：生物學(xué)廣義的概念：生物學(xué)(微生物學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)生物化學(xué))和工程學(xué)和工程學(xué)(化學(xué)工程化學(xué)工程)結(jié)合結(jié)合t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E qs / h-1 t / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F qp / h 0 0.2 0.4 0.6 0.8 m / h-1 1 2 3 -1D 狹義的發(fā)酵概念：微生物培養(yǎng)狹義的發(fā)酵概念：微生物培養(yǎng)和代謝過程和代謝過程微生物生長微生物生長底物消耗底

3、物消耗產(chǎn)物生成產(chǎn)物生成5獲得應(yīng)用價(jià)值的微生物反應(yīng)器及過程放大發(fā)酵過程優(yōu)化和控制發(fā)酵工程研究發(fā)酵工程研究發(fā)酵產(chǎn)物分離提取6發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義微生物能夠積累最大目的產(chǎn)物微生物能夠積累最大目的產(chǎn)物(產(chǎn)量產(chǎn)量)的的條件條件是什么？是什么？ 高產(chǎn)量高產(chǎn)量 便于產(chǎn)品分便于產(chǎn)品分離提取離提取關(guān)鍵問題關(guān)鍵問題1工程意義工程意義1相關(guān)：微生物生理、遺傳特性和營養(yǎng)、環(huán)境因素7底物最多被微生物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物底物最多被微生物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率)的的條件條件是什么？是什么？糧食原料為底物糧食原料為底物 高轉(zhuǎn)化率高轉(zhuǎn)化率 降低原料成本降低原料成本關(guān)鍵問題關(guān)鍵問題2工程意義工程意義2

4、相關(guān)：微生物代謝途徑和過程條件發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義8微生物最快速度發(fā)酵生產(chǎn)目的微生物最快速度發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物的產(chǎn)物的條件條件是什么？是什么？分批操作為主分批操作為主 高生產(chǎn)強(qiáng)度高生產(chǎn)強(qiáng)度 縮短生產(chǎn)周期縮短生產(chǎn)周期工程意義工程意義3關(guān)鍵問題關(guān)鍵問題3相關(guān)：微生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和系統(tǒng)優(yōu)化發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義發(fā)酵工程的關(guān)鍵問題和工程意義9條件確定過程優(yōu)化初始條件過程分析過程強(qiáng)化發(fā)酵優(yōu)化的研究思想：發(fā)酵是一個(gè)過程發(fā)酵優(yōu)化的研究思想：發(fā)酵是一個(gè)過程10基于細(xì)胞表觀特性進(jìn)行優(yōu)化基于細(xì)胞表觀特性進(jìn)行優(yōu)化0 4 8 12 16 t / h d (DCW) / (g/L)

5、 A 0 20 40 60 80 100 120 140 t / h r (Glucose) / (g/L) B 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80 t / h r (Pyruvate) / (g/L) C 基于細(xì)胞內(nèi)部分析進(jìn)行優(yōu)化基于細(xì)胞內(nèi)部分析進(jìn)行優(yōu)化高產(chǎn)量高產(chǎn)量高底高底物轉(zhuǎn)物轉(zhuǎn)化率化率高生高生產(chǎn)強(qiáng)產(chǎn)強(qiáng)度度優(yōu)化策略優(yōu)化策略在理論和技術(shù)上有突破在理論和技術(shù)上有突破, ,在工業(yè)生產(chǎn)中能廣泛應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)中能廣泛應(yīng)用顯著提高發(fā)酵過程的經(jīng)濟(jì)性和科學(xué)性研究方法研究方法111 1優(yōu)化優(yōu)化微生物生長的物理和化學(xué)環(huán)境微生物生長的物理和化學(xué)環(huán)境保證保證微生物生長處

6、于最適條件微生物生長處于最適條件基本思想奠定基礎(chǔ)基于基于底物運(yùn)輸、生化反應(yīng)、產(chǎn)物排出底物運(yùn)輸、生化反應(yīng)、產(chǎn)物排出確定確定不同環(huán)境條件對微生物生長不同環(huán)境條件對微生物生長和代謝產(chǎn)物分布的影響和代謝產(chǎn)物分布的影響Prod. Distribution發(fā)酵優(yōu)化12培養(yǎng)基組成的優(yōu)化技術(shù)發(fā)酵環(huán)境條件的優(yōu)化技術(shù) 確定培養(yǎng)基組分的最小用量，避免底物的過量或不足確定培養(yǎng)基組分的最小用量，避免底物的過量或不足減少副產(chǎn)物的形成，使底物轉(zhuǎn)化率明顯提高減少副產(chǎn)物的形成，使底物轉(zhuǎn)化率明顯提高對關(guān)鍵物質(zhì)的濃度及其供給方式進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)對關(guān)鍵物質(zhì)的濃度及其供給方式進(jìn)行優(yōu)化，使目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量明顯提高量明顯提高分析不同環(huán)境

7、條件下微生物的生理學(xué)分析不同環(huán)境條件下微生物的生理學(xué)目的 內(nèi)容132基于微生物代謝特性的分階段培養(yǎng)技術(shù)基于微生物代謝特性的分階段培養(yǎng)技術(shù)控制環(huán)境條件在最適合細(xì)胞生長或最適控制環(huán)境條件在最適合細(xì)胞生長或最適合產(chǎn)物合成的水平合產(chǎn)物合成的水平。目目的的分分析析不同不同T、pH、RPM、DO發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(，qp，qs)流變學(xué)參數(shù)的變化特性流變學(xué)參數(shù)的變化特性分階段控制策略分階段控制策略提提出出分階段分階段T、pH、RPM、DO發(fā)酵優(yōu)化14利用利用分階段培養(yǎng)技術(shù)還可以將細(xì)胞生長期和產(chǎn)物分階段培養(yǎng)技術(shù)還可以將細(xì)胞生長期和產(chǎn)物形成期人為分開形成期人為分開，從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)化發(fā)酵過程的目

8、的。，從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)化發(fā)酵過程的目的。T，pH, DO, RPM153基于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和人工智能的優(yōu)化和控制技術(shù)基于反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和人工智能的優(yōu)化和控制技術(shù)建立動(dòng)力學(xué)模型，求解參建立動(dòng)力學(xué)模型，求解參數(shù)并評價(jià)其適用性數(shù)并評價(jià)其適用性對發(fā)酵進(jìn)程和產(chǎn)量對發(fā)酵進(jìn)程和產(chǎn)量指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測ModelFormMonod Constant yieldu = umax s/(K m + s) Y x/s = Y0Substrate inhibition Constant yieldu = umax s/(Km + s + s2/Ki) Y x/s = Y0Substrate inhibition Variabl

9、e yieldu = umax s (1 - T. s)/(K m + s + s2/Ki) Y x/s = Y0 (1 - T. s)/(1 + R. s + G. s2) Substrate and product inhibition InhibitionsConstants yieldsu = umax s/(Km + s + s2/Ki) u = umax o (1 - P/P m )q p = alpha. u+ betaalpha, beta and Y p/s以數(shù)學(xué)模型為基礎(chǔ)的優(yōu)化優(yōu)化發(fā)酵過程優(yōu)化發(fā)酵過程發(fā)酵優(yōu)化16 以生理模型為基礎(chǔ)的優(yōu)化以生理模型為基礎(chǔ)的優(yōu)化采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

10、、專家系采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、專家系統(tǒng)、模糊邏輯控制技術(shù)統(tǒng)、模糊邏輯控制技術(shù)對發(fā)酵過程對發(fā)酵過程進(jìn)行在線狀進(jìn)行在線狀態(tài)預(yù)測和模態(tài)預(yù)測和模式識別式識別自適應(yīng)最優(yōu)自適應(yīng)最優(yōu)化控制系統(tǒng)化控制系統(tǒng)的開發(fā)、計(jì)的開發(fā)、計(jì)算機(jī)模擬和算機(jī)模擬和實(shí)際應(yīng)用實(shí)際應(yīng)用174參參考考已知的生化反應(yīng)計(jì)量關(guān)系、已知的生化反應(yīng)計(jì)量關(guān)系、代謝途徑、生理、特征，代謝途徑、生理、特征，構(gòu)建構(gòu)建、合成不同產(chǎn)物的合成不同產(chǎn)物的代謝網(wǎng)絡(luò)代謝網(wǎng)絡(luò)。利用利用代謝通量分析方法，代謝通量分析方法，計(jì)算計(jì)算得得出胞內(nèi)出胞內(nèi)各條代謝途徑的通量變化各條代謝途徑的通量變化。發(fā)酵優(yōu)化18分析分析不同發(fā)酵產(chǎn)品合成途徑中不同發(fā)酵產(chǎn)品合成途徑中主要代謝節(jié)點(diǎn)的性質(zhì)主

11、要代謝節(jié)點(diǎn)的性質(zhì)，結(jié)合發(fā)酵過程中胞內(nèi)能量代謝情況，結(jié)合發(fā)酵過程中胞內(nèi)能量代謝情況，提出提出一系列發(fā)酵一系列發(fā)酵優(yōu)化策略優(yōu)化策略。 19長期脅迫可遺傳性的應(yīng)長期脅迫可遺傳性的應(yīng)答（遺傳變異）答（遺傳變異）短期脅迫不可遺傳性的短期脅迫不可遺傳性的應(yīng)答（生理性的應(yīng)答（生理性的)PyruvateNAD+NADHADPATPethanolAnaerobicAerobicMitochondrionATP環(huán)境壓力或脅迫環(huán)境壓力或脅迫饑餓、高溫、高壓、機(jī)械剪切、冷凍、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、饑餓、高溫、高壓、機(jī)械剪切、冷凍、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高滲透壓（高鹽）、活性氧、有毒化學(xué)物質(zhì)等等高滲透壓（高鹽）、活性氧、有毒化學(xué)物質(zhì)等等細(xì)

12、胞結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的臨時(shí)改變，酶原的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的臨時(shí)改變，酶原的激活以及代謝途徑的臨時(shí)調(diào)整等激活以及代謝途徑的臨時(shí)調(diào)整等5基于基于環(huán)境脅迫條件下微生物生理應(yīng)答的過程環(huán)境脅迫條件下微生物生理應(yīng)答的過程優(yōu)化技術(shù)優(yōu)化技術(shù)發(fā)酵優(yōu)化20研究一些重要的工業(yè)微生物的抗脅迫因子及其抗脅迫研究一些重要的工業(yè)微生物的抗脅迫因子及其抗脅迫機(jī)制，考察環(huán)境脅迫條件下特定微生物蛋白轉(zhuǎn)錄和代機(jī)制，考察環(huán)境脅迫條件下特定微生物蛋白轉(zhuǎn)錄和代謝途徑變化，謝途徑變化，采用不同環(huán)境脅迫手段或措施對微生物采用不同環(huán)境脅迫手段或措施對微生物的生長或代謝進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)微生物生長或大量合成的生長或代謝進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)

13、微生物生長或大量合成目的產(chǎn)物。目的產(chǎn)物。 學(xué)術(shù)思想學(xué)術(shù)思想21學(xué)術(shù)思想學(xué)術(shù)思想6基于微生物代謝的輔因子調(diào)控的過程優(yōu)化技術(shù)基于微生物代謝的輔因子調(diào)控的過程優(yōu)化技術(shù)CofactorsMetal ionsNADH/NAD+NADPH/NADP+ATP/ADP/AMPCoA/Acetyl-CoAVitamins發(fā)酵優(yōu)化研究輔因子形式及其濃度在物質(zhì)代謝和信號傳遞途徑中控制代謝研究輔因子形式及其濃度在物質(zhì)代謝和信號傳遞途徑中控制代謝流方向和流量分配的作用機(jī)制、物質(zhì)流和輔因子流的變化規(guī)律，流方向和流量分配的作用機(jī)制、物質(zhì)流和輔因子流的變化規(guī)律，對微生物的生長或代謝進(jìn)行調(diào)控，對微生物的生長或代謝進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)

14、微生物合成目的產(chǎn)物的代促進(jìn)微生物合成目的產(chǎn)物的代謝流的最大化和快速化。謝流的最大化和快速化。 22蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué) 組學(xué)組學(xué)Discovery-driven轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)代謝組學(xué)代謝組學(xué) 通量組學(xué)通量組學(xué)DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù)二維電泳二維電泳/質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)多維色譜多維色譜/質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)同位素同位素-核磁共振技術(shù)核磁共振技術(shù)計(jì)算生物學(xué)計(jì)算生物學(xué)基因組模型化技術(shù)基因組模型化技術(shù)實(shí)驗(yàn)生物科學(xué)實(shí)驗(yàn)生物科學(xué)Hypothesis-driven分子遺傳學(xué)分子遺傳學(xué)分子微生物學(xué)分子微生物學(xué)蛋白質(zhì)工程蛋白質(zhì)工程結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)代謝工程代謝工程重組重組DNA技術(shù)技術(shù)蛋白質(zhì)結(jié)晶及蛋白質(zhì)結(jié)晶及晶體衍

15、射技術(shù)晶體衍射技術(shù)酶的定向酶的定向進(jìn)化技術(shù)進(jìn)化技術(shù)高通量高通量篩選技術(shù)篩選技術(shù)微生物生理學(xué)微生物生理學(xué)反向代謝反向代謝工程技術(shù)工程技術(shù)細(xì)胞功能認(rèn)識細(xì)胞功能認(rèn)識和優(yōu)化和優(yōu)化生物學(xué)知識和技術(shù)生物學(xué)知識和技術(shù)23工程學(xué)方法和規(guī)律工程學(xué)方法和規(guī)律工業(yè)生工業(yè)生物物過程過程細(xì)胞群體效應(yīng)細(xì)胞群體效應(yīng)生化、生理特性分析生化、生理特性分析物質(zhì)和能量傳遞模型物質(zhì)和能量傳遞模型過程放大原理和策略過程放大原理和策略發(fā)酵優(yōu)化發(fā)酵優(yōu)化系統(tǒng)全局優(yōu)化與集成系統(tǒng)全局優(yōu)化與集成過程優(yōu)化過程優(yōu)化細(xì)胞群體效應(yīng)調(diào)細(xì)胞群體效應(yīng)調(diào)控的直接放大控的直接放大生物生物/ /化學(xué)方法化學(xué)方法級聯(lián)的系統(tǒng)優(yōu)化級聯(lián)的系統(tǒng)優(yōu)化多產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)目標(biāo)多產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)目標(biāo)

16、的全局調(diào)控的全局調(diào)控發(fā) 現(xiàn)發(fā) 現(xiàn)和 認(rèn)和 認(rèn)識識創(chuàng) 新創(chuàng) 新技 術(shù)技 術(shù)和 方和 方法法集成集成優(yōu)化優(yōu)化細(xì)胞細(xì)胞群體群體單元單元過程過程系統(tǒng)系統(tǒng)優(yōu)化優(yōu)化反應(yīng)反應(yīng)/ /分離單元耦分離單元耦合集成合集成生物生物/ /化學(xué)級聯(lián)方化學(xué)級聯(lián)方法法多目標(biāo)聯(lián)產(chǎn)方法多目標(biāo)聯(lián)產(chǎn)方法耦合技術(shù)耦合技術(shù)基于生理特性的直基于生理特性的直接放大接放大過程集成過程集成24發(fā)酵工程研究舉例發(fā)酵工程研究舉例25舉例舉例1：丙酮酸發(fā)酵：丙酮酸發(fā)酵GlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA -KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1, NA)PDC (B1) PT

17、 (B6) PC (Bio) B1： 硫胺素硫胺素NA： 煙酸煙酸Bio：生物素：生物素B6： 吡哆醛吡哆醛GlucosePyruvate如何得到丙酮酸高產(chǎn)量發(fā)酵？如何得到丙酮酸高產(chǎn)量發(fā)酵？-菌株選育和培養(yǎng)條件優(yōu)化菌株選育和培養(yǎng)條件優(yōu)化XXXX選育自身不能合成維生素的酵母選育自身不能合成維生素的酵母( (維生素缺陷型維生素缺陷型) )控制培養(yǎng)基中維生素濃度控制培養(yǎng)基中維生素濃度Li Y ，Chen J ， Lun S. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 55:680-685, 57:471-479.Li Y, Chen J, Liang D, Lun S-Y

18、. J. Biotechnol. 2000, 81:27-3426t 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 1 2 3 E qs / h-1 t / h 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 F qp / h 0 0.2 0.4 0.6 0.8 m / h-1 1 2 3 -1D 動(dòng)力學(xué)分析高高溶氧溶氧下，丙酮酸轉(zhuǎn)下，丙酮酸轉(zhuǎn)化率較高，但生產(chǎn)強(qiáng)化率較高，但生產(chǎn)強(qiáng)度度(葡萄糖消耗速度葡萄糖消耗速度)較較低低低溶氧下，葡萄糖消低溶氧下，葡萄糖消耗速度加快，然而丙耗速度加快，然而丙酮酸產(chǎn)率卻明顯下降酮酸產(chǎn)率卻明顯下降代謝網(wǎng)絡(luò)分析PyrEt14.7P

19、EP74.65.5OAAAcCoA7.9PyrEt14.7PEP74.65.5OAAAcCoA7.9DO=10%PyrEt2.4PEP94.66.1OAAAcCoA8.7PyrEt2.4PEP94.66.1OAAAcCoA8.7DO=85%PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸進(jìn)一步代謝的通量下降了63.3%高溶氧下轉(zhuǎn)化率高的原因如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度？如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度？-分階段溶氧控制分階段溶氧控制輔因子分析NADHATP39.0NADHATP39.0NADHATP20.7NADHATP20.7總總ATP下降下降31.4%, NADH下降下降18.6%生產(chǎn)

20、強(qiáng)度(葡萄糖消耗速度)59低溶氧生產(chǎn)強(qiáng)度高的原因DO=10%DO=85%Liming Liu, *Jian Chen. Journal of Biotechnology, 2006, 126(2):173-185 Li-Ming Liu, *Jian Chen. FEMS Yeast Research, 2006, 6:11171129 27高產(chǎn)量高產(chǎn)量(89.4 g/L)高產(chǎn)率高產(chǎn)率(0.636 g/g)高生產(chǎn)強(qiáng)度高生產(chǎn)強(qiáng)度(1.95 g/(L h) 確定分階段供氧模式:發(fā)酵0-16 h控制kLa為450 h-1，16 h后將kLa降低至200 h-1碳平衡分析前16 h較高溶氧有利于碳流合

21、成細(xì)胞；采用單一高或低供氧模式，不能同時(shí)達(dá)到高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強(qiáng)度！采用單一高或低供氧模式，不能同時(shí)達(dá)到高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強(qiáng)度！16 h后耗氧速率恒定，碳流轉(zhuǎn)向合成丙酮酸結(jié)果 016h 1632h 3248h after 48h kL a / h-1 450 300 200 450 300 200 450 300 200 450 300 200 Glucose1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Cell growth2 47 30 27 17 13 16 13 13 11 3 10 11 Pyruvate 44 41 32 80 60

22、 55 83 70 57 82 78 41 Ethanol 2 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Residual carbon 7 27 39 3 27 29 5 17 32 14 12 48 如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度如何提高丙酮酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度?-?-分階段溶氧控制分階段溶氧控制分階段溶氧控制！如何分階段？分階段溶氧控制！如何分階段？Liming Liu,*Jian Chen. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97(4):825-832 Liming Liu, *Jian Chen. Journal of Bio

23、technology, 2006, 126(2):173-185 28PC (Bio)OAAGlucoseAcetateAcCoAPDH bypassPyruvateAcetaldehydeEthanolPDC (B1)PyruvatePDH (B1 )AcCoACitrateOAA -KG10 g/L59g/LAGlucosePyruvateAcetaldehydeEthanolPDC (B1)PC (Bio)OAAPyruvatePDH (B1 )AcCoACitrateOAA -KGAcetateAcCoAPDH bypass14 g/L53 g/LB輔因子調(diào)控輔因子調(diào)控打開丙酮酸脫氫酶

24、系打開丙酮酸脫氫酶系(PDH)途徑途徑打開丙酮酸羧化酶打開丙酮酸羧化酶(PC)途徑途徑29 L Liu, Y Li, Z Shi, G Du, *J Chen. Metabolic Engineering, 2007, 9(1):21-29 GlucosePyruvateAcetaldehydeEthanolPDC (B1)PC (Bio)OAAPyruvatePDH (B1)AcCoACitrateOAA -KGAcetateAcCoAPDH bypass21 g/L48g/LCGlucosePyruvateAcetaldehydeEthanolPDC (B1)PC (Bio)OAAPyru

25、vatePDH (B1)AcCoACitrateOAA -KGAcetateAcCoAPDH bypass44 g/L22 g/LCaCO3D同時(shí)打開添加Ca2+離子，PC活性受Ca2+所激活30舉例舉例2 2：維生素維生素C C發(fā)酵微生物的功能優(yōu)化與調(diào)控發(fā)酵微生物的功能優(yōu)化與調(diào)控我國是世界最大的維生素我國是世界最大的維生素C生產(chǎn)國和出口國，生產(chǎn)國和出口國，2008年生產(chǎn)年生產(chǎn)85000噸，產(chǎn)值噸，產(chǎn)值40億，占世界市場億，占世界市場90 小菌小菌(氧化葡萄糖氧化葡萄糖桿菌桿菌G. oxydans )大菌大菌(巨大芽孢桿巨大芽孢桿菌菌B. megaterium )關(guān)鍵科學(xué)問題：維生素關(guān)鍵科學(xué)問

26、題：維生素C C發(fā)酵微生物的功能關(guān)系發(fā)酵微生物的功能關(guān)系GluVc現(xiàn)況：維生素現(xiàn)況：維生素C兩步發(fā)酵工藝兩步發(fā)酵工藝小菌單獨(dú)培養(yǎng)生長、產(chǎn)酸困難小菌單獨(dú)培養(yǎng)生長、產(chǎn)酸困難大菌本身不產(chǎn)酸，促進(jìn)小菌生長和產(chǎn)酸大菌本身不產(chǎn)酸，促進(jìn)小菌生長和產(chǎn)酸團(tuán)隊(duì)承擔(dān)的國家團(tuán)隊(duì)承擔(dān)的國家863重重點(diǎn)項(xiàng)目和國家支撐項(xiàng)目點(diǎn)項(xiàng)目和國家支撐項(xiàng)目與南開大學(xué)功能基因組與南開大學(xué)功能基因組學(xué)中心、國內(nèi)最大學(xué)中心、國內(nèi)最大Vc生生產(chǎn)企業(yè)合作產(chǎn)企業(yè)合作實(shí)現(xiàn)組學(xué)技術(shù)解決發(fā)酵實(shí)現(xiàn)組學(xué)技術(shù)解決發(fā)酵工業(yè)長期問題的典型工業(yè)長期問題的典型31基因組測序步驟鳥槍法測序鳥槍法測序提取基因提取基因組組DNA打斷基因打斷基因組組DNA基因文基因文庫構(gòu)建庫

27、構(gòu)建大規(guī)模大規(guī)模測序測序羅氏羅氏GSFLX高通量基因組測序高通量基因組測序 銜接子銜接子連接連接單鏈單鏈DNA與與磁珠結(jié)合磁珠結(jié)合油滴中油滴中PCR反應(yīng)反應(yīng)序列拼接序列拼接測序測序反應(yīng)反應(yīng)填補(bǔ)缺口填補(bǔ)缺口基因組注釋基因組注釋代謝途徑分析代謝途徑分析小菌測序小菌測序大菌測序大菌測序代謝途徑分析代謝途徑分析代謝途徑分析代謝途徑分析從代謝從代謝途徑角途徑角度解析度解析兩菌關(guān)兩菌關(guān)系系32氧化葡萄糖酸桿菌中心代謝途徑分析氧化葡萄糖酸桿菌中心代謝途徑分析缺失編碼琥珀酸鹽脫氫酶的基因，缺失編碼琥珀酸鹽脫氫酶的基因，檸檬酸循環(huán)不完全檸檬酸循環(huán)不完全無編碼磷酸烯醇式丙酮酸合成酶無編碼磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，不

28、能通過糖異生生產(chǎn)，不能通過糖異生生產(chǎn)C6G.oxydans基因組含編碼氧化戊糖磷酸基因組含編碼氧化戊糖磷酸途徑和途徑和D途徑的全部酶基因途徑的全部酶基因缺失編碼磷酸缺失編碼磷酸果糖激酶的基果糖激酶的基因，糖酵解途因，糖酵解途徑不完全徑不完全33蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)小菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)小菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)胞內(nèi)蛋白表達(dá)胞內(nèi)蛋白表達(dá)大菌存在時(shí)小菌大菌存在時(shí)小菌胞內(nèi)蛋白表達(dá)胞內(nèi)蛋白表達(dá)功能蛋白確定功能蛋白確定，研究大菌影，研究大菌影響小菌產(chǎn)酸的響小菌產(chǎn)酸的機(jī)制機(jī)制K. VulgarB. megaterium34發(fā)酵發(fā)酵優(yōu)化優(yōu)化提高糖酸轉(zhuǎn)化率提高糖酸轉(zhuǎn)化率提高提高VC產(chǎn)量產(chǎn)量提高生產(chǎn)強(qiáng)度提高生產(chǎn)強(qiáng)度基因基因測序測序

29、功能功能蛋白蛋白產(chǎn)物產(chǎn)物解析解析3-磷酸磷酸甘油醛甘油醛丙酮酸丙酮酸葡萄糖葡萄糖TCA循環(huán)循環(huán)大菌特定的代謝途徑大菌特定的代謝途徑L-山梨酮山梨酮2-酮基酮基-L-古龍古龍酸酸L-山梨糖山梨糖2-酮基酮基-L-古龍酸生產(chǎn)途徑古龍酸生產(chǎn)途徑Vc目標(biāo)目標(biāo)1：確定微生物之間的功能關(guān)系，提高效能：確定微生物之間的功能關(guān)系，提高效能目標(biāo)目標(biāo)2：構(gòu)建：構(gòu)建Vc一步發(fā)酵菌株，實(shí)現(xiàn)重大創(chuàng)新一步發(fā)酵菌株，實(shí)現(xiàn)重大創(chuàng)新舉例舉例2 2：維生素維生素C C發(fā)酵微生物的功能優(yōu)化與調(diào)控發(fā)酵微生物的功能優(yōu)化與調(diào)控35棉織物化學(xué)前處理工藝棉織物化學(xué)前處理工藝SingeingDesizing ScouringBleaching

30、退漿退漿 淀粉、淀粉、PVA精練精練角質(zhì)、果膠角質(zhì)、果膠漂白漂白H2O2化學(xué)品化學(xué)品/ /高溫高溫化學(xué)品化學(xué)品/ /高溫高溫化學(xué)品化學(xué)品/ /高溫高溫四種酶發(fā)酵四種酶發(fā)酵與應(yīng)用的系與應(yīng)用的系統(tǒng)控制優(yōu)化統(tǒng)控制優(yōu)化效果：效果：提高質(zhì)量提高質(zhì)量 節(jié)省能源節(jié)省能源 減少排放減少排放國內(nèi)外：加國內(nèi)外：加酶處理工藝酶處理工藝本課題：本課題：全生物處全生物處理工藝?yán)砉に囆б妫盒б妫喊l(fā)酵產(chǎn)值發(fā)酵產(chǎn)值5億億節(jié)能能耗節(jié)能能耗15億億環(huán)境效益環(huán)境效益30億億舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)SingeingDesizing ScouringBleaching退漿退漿 淀粉、淀粉

31、、PVA精練精練角質(zhì)、果膠角質(zhì)、果膠漂白漂白H2O2淀粉酶淀粉酶/PVA/PVA酶酶角質(zhì)酶角質(zhì)酶/ /果膠酶果膠酶過氧化氫酶過氧化氫酶棉織物生物前處理工藝棉織物生物前處理工藝36高產(chǎn)菌株選育高產(chǎn)菌株選育產(chǎn)酶微生物篩選產(chǎn)酶微生物篩選菌株鑒定和遺傳改造菌株鑒定和遺傳改造分子克隆和工程菌構(gòu)建分子克隆和工程菌構(gòu)建發(fā)酵過程研究發(fā)酵過程研究酶的分離與純化酶的分離與純化培養(yǎng)基和條件確定培養(yǎng)基和條件確定發(fā)酵過程優(yōu)化策略發(fā)酵過程優(yōu)化策略過程放大和工業(yè)化過程放大和工業(yè)化分段控制分段控制流加發(fā)酵流加發(fā)酵低成本低成本放大技術(shù)放大技術(shù)分離與純化方法分離與純化方法酶的基本性質(zhì)酶的基本性質(zhì)工業(yè)化提取技術(shù)工業(yè)化提取技術(shù)誘導(dǎo)脅

32、迫誘導(dǎo)脅迫舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)37酶制劑應(yīng)用酶制劑應(yīng)用酶應(yīng)用特性和作用機(jī)理酶應(yīng)用特性和作用機(jī)理復(fù)合酶和酶組分復(fù)配復(fù)合酶和酶組分復(fù)配過程模擬和最佳條件過程模擬和最佳條件應(yīng)用效果評價(jià)應(yīng)用效果評價(jià)應(yīng)用效果比較研究應(yīng)用效果比較研究經(jīng)濟(jì)學(xué)評價(jià)經(jīng)濟(jì)學(xué)評價(jià)環(huán)境效益分析環(huán)境效益分析舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)38野生菌篩選與發(fā)酵野生菌篩選與發(fā)酵提取高純度天然蛋白提取高純度天然蛋白電泳電泳主要斑點(diǎn)主要斑點(diǎn)N端測序端測序或肽指紋術(shù)分析或肽指紋術(shù)分析N端序列端序列/肽段分肽段分子量數(shù)據(jù)庫查詢子量數(shù)據(jù)庫查詢獲得基因獲得基因

33、N端測序端測序設(shè)計(jì)核苷酸探針雜交設(shè)計(jì)核苷酸探針雜交獲得基因獲得基因生物數(shù)據(jù)庫查詢生物數(shù)據(jù)庫查詢同源序列同源序列保守序列分析保守序列分析設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增相關(guān)序列片斷相關(guān)序列片斷獲得基因獲得基因若出發(fā)菌基因組序列為若出發(fā)菌基因組序列為已知已知若出發(fā)菌基因組序列若出發(fā)菌基因組序列未知未知Thermobifida fusca 角質(zhì)酶角質(zhì)酶角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建細(xì)菌來源角質(zhì)酶編碼基因目前在國細(xì)菌來源角質(zhì)酶編碼基因目前在國內(nèi)外未有報(bào)道內(nèi)外未有報(bào)道 酶制劑基因鑒定流程酶制劑基因鑒定流程舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)39Purification

34、stepTotal protein (mg)Total activity (U)Specific activity (U/mg)Purification foldYield (%)Crude enzyme234.9 1229452.34 1 100 (NH4)2SO4 fractionation46.4 5205.2112.182.1442.34Phenyl HPSepharose FF4.75 1521.24320.266.1212.37DEAE Sepharose FF2.86 1140.91398.607.619.28Table I Summary of purification of

35、wild-type cutinase from T. fusca天然嗜熱子囊菌角質(zhì)酶的純化天然嗜熱子囊菌角質(zhì)酶的純化通過硫酸銨沉淀、疏水色譜、陰離子交換色譜從嗜熱子囊菌發(fā)酵液中分離純化得到電泳通過硫酸銨沉淀、疏水色譜、陰離子交換色譜從嗜熱子囊菌發(fā)酵液中分離純化得到電泳純天然角質(zhì)酶純天然角質(zhì)酶角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)40肽指紋圖譜鑒定角質(zhì)酶基因肽指紋圖譜鑒定角質(zhì)酶基因?qū)﹄娪炯兲烊唤琴|(zhì)酶進(jìn)行肽指紋圖譜分析，通過數(shù)據(jù)庫比對，得到角質(zhì)酶的編碼基因?qū)﹄娪炯兲烊唤琴|(zhì)酶進(jìn)行肽指紋圖譜分析，通過數(shù)據(jù)庫比對，得到角質(zhì)酶的編碼基因

36、(Tfu_0883)角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)41Tfu 0883/pET-20b(+)4558 bpbla (A p) sequenceCutinaseHis tagT7 promoterC olE1 pBR322 originf1 originT7 terminatorpelB sequenceBamHI (199)NcoI (1063)Tfu_0883的克隆、表達(dá)和純化的克隆、表達(dá)和純化通過基因工程手段使角質(zhì)酶基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，工程菌發(fā)酵液酶活達(dá)通過基因工程手段使角質(zhì)酶基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，工程

37、菌發(fā)酵液酶活達(dá)180 U/mL，是野生菌產(chǎn)酶的，是野生菌產(chǎn)酶的9.4倍。倍。C u tin h y d r o ly sis p r o d u c ts F .so la n i c u tin a se h y d r o ly sis A e r a (% ) T . fu sc a c u tin a se (T fu _ 0 8 8 2 ) h y d r o ly sis A e r a (% ) T . fu sc a c u tin a se (T fu _ 0 8 8 3 ) h y d r o ly sis A e r a (% ) H e x a d e c a n o

38、ic a c id 1 5 .9 4 2 .6 2 9 .2 7 2 .0 7 1 0 .9 6 2 .8 9 9 -H e x a d e c e n o ic a c id 0 .1 3 0 .0 2 0 .0 6 0 .0 2 0 .0 9 0 .0 3 O c ta d e c a n o ic a c id 1 4 .9 9 1 .7 1 9 .2 4 3 .0 1 8 .7 7 2 .6 9 9 -O c ta d e c e n o ic a c id 1 .7 4 0 .6 1 0 .9 8 0 .3 6 1 .1 6 0 .7 9 9 ,1 2 -O c ta d e c a

39、 d ie n o ic a c id 1 .0 8 0 .2 3 1 .3 2 0 .3 7 1 .0 6 0 .2 3 1 6 - H y d r o x y h e x a d e c a n o ic a c id 1 .6 5 0 .3 1 5 .6 6 1 .1 4 4 .7 4 0 .5 4 1 0 ， 1 6 - d ih y d r o x y h e x a d e c a n o ic a c id 1 0 .1 8 1 .1 2 8 .2 9 2 .3 5 9 .1 5 0 .9 7 1 8 -h y d r o x y o c ta d e c a -9 -e n o

40、 ic a c id 1 .9 0 0 .3 4 1 .0 3 0 .3 2 1 .5 2 0 .1 2 1 8 -h y d r o x y o c ta d e c a -9 ,1 2 -d ie n o ic a c id 1 .9 8 0 .9 8 9 .1 9 2 .2 5 1 0 .9 1 1 .0 7 9 , 1 0 , 1 8 -tr ih y d r o x y o c ta d e c a n o ic a c id 1 .9 5 0 .4 2 0 .9 9 0 .1 7 1 .7 8 0 .3 5 重組重組 Tfu0883具有角質(zhì)酶活性具有角質(zhì)酶活性 pET-20b(+)

41、, pelB as signal peptide, C-terminal His-tag E. coli BL21(DE3)Rossetta Ammonia sulfate precipitation, Ni-column角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建角質(zhì)酶高產(chǎn)菌的構(gòu)建舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)42調(diào)控調(diào)控PGL發(fā)酵過程中底物甘油發(fā)酵過程中底物甘油的濃度和誘導(dǎo)物甲醇的濃度，的濃度和誘導(dǎo)物甲醇的濃度，實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)PGL的高產(chǎn)量和高生產(chǎn)強(qiáng)的高產(chǎn)量和高生產(chǎn)強(qiáng)度度圖2-3 甲醇和菌體濃度的比值對PGL產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和單位細(xì)胞生產(chǎn)PGL的能力的影響 PGL/100 PGL

42、productivity PGL production per cell1000前期研究結(jié)果舉例：前期研究結(jié)果舉例：甲醇和菌體濃度比值的影響甲醇和菌體濃度比值的影響底物流加研究目標(biāo)底物流加研究目標(biāo)流加策略流加策略甲醇流加：控制甲醇流甲醇流加：控制甲醇流 速，將速，將甲醇和菌體濃度比值維持在甲醇和菌體濃度比值維持在0.165 g/g左右左右 甘油流加：細(xì)胞快速生長，達(dá)甘油流加：細(xì)胞快速生長，達(dá)高密度；高密度；重組重組P. pastoris高密度發(fā)酵生產(chǎn)高密度發(fā)酵生產(chǎn)PGL的底物流加策略和溫度誘導(dǎo)的底物流加策略和溫度誘導(dǎo)舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)43菌

43、體生長階段的甘油流加策略菌體生長階段的甘油流加策略010 20 30 40 50 60 7002040608010002004006008001000DO (%)時(shí)間 (h)攪拌速率 (r/min) B010 20 30 40 50 60 70020406080100120140160020406080100DCW, 甘油 (g/L)時(shí)間 (h)流加速率 (mL/h) A 細(xì)胞干重在細(xì)胞干重在63 h 達(dá)達(dá)到到122 g/L細(xì)胞干重在細(xì)胞干重在33 h達(dá)達(dá)到到140 g/L0510 15 20 25 30 3502040608010002004006008001000DO (%)時(shí)間 (h)攪

44、拌速率 (r/min) B0510 15 20 25 30 35020406080100120140160020406080100120DCW, 甘油 (g/L)時(shí)間 (h)流加速率 (mL/h) A重組重組P. pastoris高密度發(fā)酵生產(chǎn)高密度發(fā)酵生產(chǎn)PGL的底物流加策略和溫度誘導(dǎo)的底物流加策略和溫度誘導(dǎo)舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)44誘導(dǎo)階段的甲醇流加策略誘導(dǎo)階段的甲醇流加策略 0244872961200100200300400500010203040506070DCW, 甲醇 (g/L), PGL (U/mL)時(shí)間 (h) DO (%),

45、F (mL/h), qs (g/g DCW/h)圖2-6 甲醇流加控制下的發(fā)酵過程曲線 DCW PGL Methanol Feeding rate - - - qs1000 DO誘導(dǎo)前期誘導(dǎo)前期(08 h)以以2 ml/h的速的速 度逐步提高甲醇流加速度，使度逐步提高甲醇流加速度，使 培養(yǎng)液中甲醇濃度接近培養(yǎng)液中甲醇濃度接近20 g/L；(2) 誘導(dǎo)中期誘導(dǎo)中期(890 h)將甲醇流加將甲醇流加 速度控制在速度控制在9.7 mL/h以維持體以維持體 系中甲醇濃度為系中甲醇濃度為20 g/L； 誘導(dǎo)后期誘導(dǎo)后期(90 h以后以后)，DO上升，上升， 將流速維持在將流速維持在2 mL/h。成功將甲

46、醇與菌體濃度比例控制成功將甲醇與菌體濃度比例控制0.1630.171 g/g。發(fā)酵結(jié)束時(shí)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)PGL酶活達(dá)到酶活達(dá)到430 U/mL，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到4.34 U/mL/h。 重組重組P. pastoris高密度發(fā)酵生產(chǎn)高密度發(fā)酵生產(chǎn)PGL的底物流加策略和溫度誘導(dǎo)的底物流加策略和溫度誘導(dǎo)舉例舉例3：染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)染整關(guān)鍵酶制劑的發(fā)酵與應(yīng)用技術(shù)45舉例舉例4 4：透明質(zhì)酸發(fā)酵過程優(yōu)化與控制：透明質(zhì)酸發(fā)酵過程優(yōu)化與控制透明質(zhì)酸三級結(jié)構(gòu)透明質(zhì)酸三級結(jié)構(gòu)優(yōu)良理化性質(zhì)：粘彈性優(yōu)良理化性質(zhì)：粘彈性 高保濕性高保濕性 生物相容性生物相容性 食品添加劑食品添加劑關(guān)節(jié)炎治療關(guān)節(jié)炎

47、治療化妝美容化妝美容高粘度和低溶氧傳遞速率是高粘度和低溶氧傳遞速率是HA發(fā)酵過程的重要瓶頸發(fā)酵過程的重要瓶頸乳酸對細(xì)胞生長和乳酸對細(xì)胞生長和HA合成有著較強(qiáng)的抑制作用合成有著較強(qiáng)的抑制作用細(xì)胞生長和細(xì)胞生長和HA合成之間存在對碳源和關(guān)鍵輔因子的競爭合成之間存在對碳源和關(guān)鍵輔因子的競爭HA發(fā)發(fā)酵存在酵存在問題問題46透明質(zhì)酸發(fā)酵過程的混合與傳質(zhì)特性優(yōu)化研究透明質(zhì)酸發(fā)酵過程的混合與傳質(zhì)特性優(yōu)化研究問題問題()()高粘度和低溶氧傳遞速率是高粘度和低溶氧傳遞速率是HA發(fā)酵過程的重要瓶頸發(fā)酵過程的重要瓶頸溶氧溶氧水平水平表觀表觀黏度黏度有效攪有效攪拌區(qū)域拌區(qū)域體積體積溶氧傳溶氧傳遞系數(shù)遞系數(shù)0nK322

48、21.36cofDPN DDr350.001opPNNDr(%)100cafTVT有效攪拌區(qū)域模型有效攪拌區(qū)域模型051015200200400600Culture time (h)Agitation speed (rpm)051015200100200300400500Culture time (h)Broth viscosity (mPas)051015200204060Culture time (h)KLa (h-1)051015200306090120120Culture time (h)DO level (%)(a)(b)(c)(d)有效攪拌區(qū)域控制模型的混合與傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)有效攪拌區(qū)域

49、控制模型的混合與傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)(Va=1）剪切力對菌體形態(tài)影響剪切力對菌體形態(tài)影響理想理想HAHA發(fā)酵模式：低剪切、高傳質(zhì)、高溶氧發(fā)酵模式：低剪切、高傳質(zhì)、高溶氧47降解透明質(zhì)酸提高發(fā)酵過程的混合及傳質(zhì)效率降解透明質(zhì)酸提高發(fā)酵過程的混合及傳質(zhì)效率問題問題()()高粘度和低溶氧傳遞速率是高粘度和低溶氧傳遞速率是HA發(fā)酵過程的重要瓶頸發(fā)酵過程的重要瓶頸酶法降解酶法降解HA提高混提高混合與傳質(zhì)效率合與傳質(zhì)效率氧化還原降解氧化還原降解HA提高混合與傳質(zhì)效率提高混合與傳質(zhì)效率FT-IR分析結(jié)果分析結(jié)果過氧化氫過氧化氫/抗壞血酸氧化還原降解抗壞血酸氧化還原降解HA 氧化還原氧化還原降解降解HA沒沒有破壞其有破

50、壞其基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)單元單元05101520051015Culture time (h)Cell concentration (g/L)05101520020406080Culture time (h)Sucrose concentration (g/L)0510152002468Culture time (h)HA concentration (g/L)051015200204060Culture time (h)Lactic acid concentration (g/L)(a)(b)(c)(d)HA氧化還原降解對氧化還原降解對HA發(fā)酵的影響發(fā)酵的影響添加添加H2O2/ /抗壞血酸對流體力

51、學(xué)影響抗壞血酸對流體力學(xué)影響48Transglutaminase (TGase, Protein glutamine -glutamyltransferase, EC 2.3.2.13 )舉例舉例5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization 通過通過 N-(-谷酰胺谷酰胺) 賴氨酸鍵交聯(lián)蛋白質(zhì)賴氨酸鍵交聯(lián)蛋白質(zhì) 催化蛋白質(zhì)中催化蛋白質(zhì)中Gln的的-羧酰胺基與伯胺間發(fā)羧酰胺基與伯胺間發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)生轉(zhuǎn)移反應(yīng) 蛋白質(zhì)脫酰胺作用蛋白質(zhì)脫酰胺作用 通過形成脂鍵共價(jià)連接蛋白質(zhì)和脂肪酸的長通過形成脂鍵共價(jià)連接蛋

52、白質(zhì)和脂肪酸的長鏈鏈-羥基羥基 目前唯一商業(yè)化并大規(guī)模生產(chǎn)的可在蛋白質(zhì)目前唯一商業(yè)化并大規(guī)模生產(chǎn)的可在蛋白質(zhì)間形成共價(jià)交聯(lián)的酶制劑間形成共價(jià)交聯(lián)的酶制劑49Activation Mechanism of TransglutaminasePre-Pro-TGaseSecreted from cells folding Pro-TGaseInhibitor (TAPI)InhibitionProtease-inhibitor complexsactivationSerine ProteaseMetalloProteaseTGasePro-region (AAs)+Dongxu Zhang, Jin

53、g Wu, Miao Wang, Guocheng Du, Jian Chen. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008 (in press). DIO:10.1021/jf8008519 Dongxu Zhang, Miao Wang, Guocheng Du, Qingxin Zhao, Jing Wu, Jian Chen. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008, 56 (9): 34033408.TAPI: surfactant protein舉例舉例5： Transg

54、lutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization50根據(jù)該根據(jù)該TGase活化模型：在發(fā)酵過程的產(chǎn)酶初期活化模型：在發(fā)酵過程的產(chǎn)酶初期:*添加添加10 mg/mL的的CTAB，使發(fā)酵過程酶活提高，使發(fā)酵過程酶活提高21.8 %；*添加添加1000 U/mL的胰蛋白酶，使發(fā)酵過程酶活提高的胰蛋白酶，使發(fā)酵過程酶活提高31.2 %。舉例舉例5： Transglutaminase: Activation Mechanism and Fermentation Optimization51Transglutaminase Fer

55、mentation G lucose G 6P F6P G A P G 3P P E P P yr O A A R 5P H is S er C ys Trp P he Tyr A la Val L eu A sp G ly Lys T hr M et A sn Ile A cC oA C it A K G G lu P ro A rg G ln A m ino acids for other proteins A m ino acids for T G ase H is C ys S er G ly Trp P he Tyr A la Val L eu A sp A sn M et T hr

56、 Lys Ile G ln A rg P ro G lu Determine of culture medium by Analysis of amino acid metabolism using mass balances Amino acid metabolic anylysis of Streptomyces Mobaraense Guoliang Yan, Guocheng Du, Yin Li, Jian Chen, Jianjing Zhong. Process Biochemistry. 2005, 40:963-968. M. Y. Zheng, Guocheng Du, J. Chen. Enzyme and Microbial Technology，2002，31(4):477-481 . Two-stage pH and agitation speed control strategy for TGase fermentation. DO1DO2DO2DO1pH1pH2舉例舉例5： Transglutaminase: Activation M