枯草桿菌彈性蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選與鑒定-

1、收稿日期:2001-03-12作者簡(jiǎn)介:王金英(1964-,女,實(shí)驗(yàn)師,大專(zhuān),從事食品釀造、保健食品研發(fā)工作,獲省級(jí)獎(jiǎng)1項(xiàng),發(fā)表論文10篇。中圖分類(lèi)號(hào):Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1004-311X (200102-0030-03枯草桿菌彈性蛋白酶高產(chǎn)菌株的篩選與鑒定王金英,劉宇峰,孫岸弢(黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所黑龍江哈爾濱150010摘要:從稻草中初篩出14株具有溶解彈性蛋白作用的G +產(chǎn)芽孢桿菌,經(jīng)分離純化篩選誘變,并進(jìn)行生理生化鑒定后,得到2株產(chǎn)酶活較高的枯草芽孢桿菌B.subtilis HW236-5和HW245-1,作為制備抗動(dòng)脈粥樣硬化枯草桿菌彈性酶的產(chǎn)酶菌株。

2、關(guān)鍵詞:枯草桿菌;彈性蛋白酶彈性蛋白酶(Elastase 是一種以分解不溶性彈性蛋白酶為特征的廣譜蛋白水解酶,是治療高血脂癥,防治動(dòng)脈粥樣硬化癥的生化藥物。它既可由動(dòng)物胰臟提取,也可由微生物發(fā)酵制得1。來(lái)源不同的微生物彈性蛋白酶都能降解其天然底物彈性硬蛋白,作為同功不同源的蛋白酶,其特點(diǎn)、性質(zhì)、分子量、電點(diǎn)等有所差異,但都是一種廣譜的肽鏈內(nèi)切酶,具有較廣的水解特性2,不僅能降解彈性蛋白,而且對(duì)酪蛋白、明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質(zhì)都能分解,作用效果與胰彈性酶相同相似,本研究篩選出彈性蛋白酶的枯草桿菌產(chǎn)生菌株,以探討工業(yè)化生產(chǎn)的可能性。1材料與方法1.1材料與試劑產(chǎn)品(E -16

3、25;剛果紅彈性蛋白(E-lastin -Congo Red ,中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品。1.2培養(yǎng)基(%:牛肉膏1.0;蛋白胨1.0;蔗糖1.0;NaCl 0.5;瓊脂2.0;pH6.8。(%:彈性蛋白0.5;酵母膏0.1;葡萄糖0.1;MgSO 47H 2O 0.01;K 2HPO 40.1;KH 2PO 40.05;瓊脂2.0;pH7.0。(%:干酪素3.0;葡萄糖4.0;玉米提取液0.2;K 2HPO 40.2;MgSO 47H 2O 0.01;pH6.0。1.3方法取稻草數(shù)根剪碎,放入三角瓶中,加水沒(méi)過(guò)干草,裝量不超過(guò)瓶容量的1/2,加石灰少許,塞好棉塞,煮沸5min ,殺死無(wú)芽孢

4、的細(xì)菌,置3037培養(yǎng)48h ,液面出現(xiàn)白色菌膜后,用壓滴法觀察桿菌的運(yùn)動(dòng),再通過(guò)染色法觀察菌體及芽孢。取該培養(yǎng)液在平板培養(yǎng)基上涂布和劃線,進(jìn)行菌種分離后,將單菌落劃線到斜面培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆?。取斜面保存的菌種稀釋涂布于平板培養(yǎng)基上,形成單菌落后,點(diǎn)種于彈性蛋白初篩平板進(jìn)行初篩。選擇水解彈性蛋白所形成的透明圈直徑與菌徑之比較大的菌落劃線到斜面培養(yǎng)基上,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,測(cè)定發(fā)酵液彈性蛋白酶的活力。參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)二部六冊(cè)P122P124。誘變法:見(jiàn)文獻(xiàn)3。2結(jié)果與討論2.1從稻草中篩出17株可使彈性蛋白溶解的桿菌,經(jīng)液體培養(yǎng)復(fù)篩出4株產(chǎn)酶較高菌株236、245、Na -7、N -

5、12,再對(duì)這4株菌進(jìn)行誘變又得到14株236菌、6株245菌、17株Na -7菌、8株N -12菌,經(jīng)比較彈性蛋白的溶解透明圈與菌徑之比,選取較大的4株菌株進(jìn)行液體發(fā)酵試驗(yàn),最后選定236-5和245-1作為產(chǎn)彈性蛋白酶菌株,結(jié)果見(jiàn)表1。表1產(chǎn)彈性蛋白酶菌株的篩選菌株號(hào)透明圈直徑與菌徑之比蛋白酶活力(u /ml 彈性酶活力(u /ml 236-12.2菌株236-5與245-1的菌落形態(tài)及生長(zhǎng)特征:236-5和245-1均與B.subtilis 標(biāo)準(zhǔn)菌的特征相同,菌落表面褶皺,圓形,不規(guī)則,無(wú)光澤,不透明,白色菌落直徑2mm -3mm ,粗糙。在1%葡萄糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管的穿刺表面生長(zhǎng)物變厚。2.

6、3菌株236-5與245-1菌體及生理生化特征:試驗(yàn)觀察,236-5與245-1的特征均與枯草桿菌的典型特征相同,根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版P732P735,對(duì)于典型枯草桿菌的描述,可鑒定為枯草桿菌,遂命名為HW236-5和HW245-1。2.4討論通過(guò)對(duì)HW236-5與HW245-1兩株菌的產(chǎn)彈性蛋白酶活性和生理生化及菌體菌落特性的大量試驗(yàn)研究,該兩株菌與B.subtilis 標(biāo)準(zhǔn)株的菌學(xué)特性基本相同,因此可以確定HW236-5與HW245-1兩株菌系為枯草芽孢桿菌,并且具有產(chǎn)生彈性蛋白酶的能力,其產(chǎn)酶能力基本與國(guó)外5-7報(bào)道的其它微生物產(chǎn)彈性菌種相似。同時(shí)因?yàn)檫@兩株菌營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單,產(chǎn)酶

7、迅速,故極有可能作為微生物彈性蛋白酶的菌株。參考文獻(xiàn):北京:科技出版社,117.2唐寶英,朱曉慧.微生物彈性蛋白酶研究概況J .工業(yè)微生物,1998,28(1:40-44.3章名春.工業(yè)微生物誘變育種M .第1版.北京:科學(xué)出版社,1984,111-127.4中國(guó)科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類(lèi)組.一般組藥常用鑒定方法M .第1版.北京:科學(xué)出版社,1979,111-193.5北京師范大學(xué)生物系.怎樣改變與培養(yǎng)微生物M .第1版.北京:北京師范大學(xué)出版社,1982,925.6Ying Chieh T sai ,Shuen Fuh Lin ,Ywan Feng Li.Characterizationof an alkaline elastase from alkal