糖化溫度、pH、時(shí)間、原料對(duì)酚酸和 氨基酸溶解的影響 - 副本

1、.糖化溫度、pH值、時(shí)間、原料對(duì)酚酸和氨基酸溶解的影響華潤(rùn)雪花啤酒（河北）有限公司 石秀云 摘譯【摘要】本文旨在研究小麥啤酒最佳的糖化條件。糖化工藝參數(shù)，如溫度、pH值、時(shí)間應(yīng)提供淀粉酶和蛋白酶最佳的酶解條件，使阿魏酸、對(duì)香豆酸、氨基酸最大程度溶解。這些酚酸是揮發(fā)性芳香酚類物質(zhì)4-乙烯基苯酚（4VP）和4-乙烯基-2-甲基-苯酚（4VG）的前體物質(zhì)。高級(jí)醇和酯類物質(zhì)，如苯乙醇、乙酸異戊酯，決定著小麥啤酒的風(fēng)味和口感。最佳的糖化條件還應(yīng)降低含苯乙烯基類物質(zhì)的溶解度。苯乙烯類物質(zhì)普遍存在于谷物中，小麥啤酒釀造過(guò)程中在加熱和酶促作用下轉(zhuǎn)化為有害物質(zhì)苯乙酸。試驗(yàn)參數(shù)，特別是糖化pH,對(duì)試驗(yàn)?zāi)康牡膶?shí)現(xiàn)起

2、著決定性作用。此外，還研究了不同麥芽和原料對(duì)酚酸和氨基酸溶解的影響。【關(guān)鍵詞】氨基酸、苯丙烯酸、阿魏酸、糖化條件、對(duì)香豆酸、小麥啤酒香氣引言酚酸廣泛存在于各種香草和麥芽制品中。其中阿魏酸、對(duì)香豆酸是4-乙烯基苯酚（4VP）和4-乙烯基-2-甲基-苯酚（4VG）的前體物質(zhì)，是重要的酚酸物質(zhì)，對(duì)啤酒風(fēng)味起重要作用。這些酚酸在酶促或加熱作用下生成相應(yīng)的多酚（見(jiàn)圖1）。阿魏酸，最常見(jiàn)的羥基肉桂酸，多通過(guò)酯鍵與多糖交聯(lián)存在于植物細(xì)胞壁中。這種結(jié)構(gòu)能被各種酶酶解成相應(yīng)的物質(zhì)：被阿魏酸酯酶酶解成阿拉伯糖和阿魏酸；被-(1-4)木聚糖內(nèi)切酶酶解成低聚木糖；被-D- 木糖酶酶解成木糖和低聚木糖；被L-阿拉伯呋喃

3、糖酶酶解成相應(yīng)的阿拉伯呋喃糖。因而，阿魏酸對(duì)植物細(xì)胞壁的穩(wěn)定性與彈性有著顯著作用。此外，阿魏酸也是一種抗氧化劑，能清除自由基。糖化過(guò)程中，糧食內(nèi)的苯丙烯酸同阿魏酸、對(duì)香豆酸一起溶解出來(lái)，在加熱或酶解下脫羧降解成苯乙烯，而苯乙烯對(duì)小麥啤酒風(fēng)味無(wú)顯著作用。高純苯乙烯是種可揮發(fā)性芳香液體，合成聚苯乙烯的單體。而聚苯乙烯用于制作各種絕緣體及一次性泡沫飯盒。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將苯乙烯歸為很可能致癌物質(zhì)（B組），暫定每日允許攝入量為0.4ug/kg(體重)。按照暫定每日允許攝入量攝入苯乙烯，可能危害人體健康。目前檢測(cè)出各種小麥啤酒麥汁中的苯丙烯酸含量在75ug/l和375ug/l之間，低于阿魏酸和對(duì)香豆酸

4、含量,而小麥啤酒中苯乙烯濃度高于24ug/l。與酚酸相似，在羧肽酶、二肽酶、氨基肽酶酶解下，氨基酸溶解出。發(fā)酵過(guò)程中，在酶的作用下，氨基酸被酵母代謝合成為酯類和高級(jí)醇類的前體物質(zhì)。氨基酸，特別是苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸對(duì)小麥啤酒水果味和麥芽味起決定性作用。酵母通過(guò)Ehrlich 途徑合成發(fā)酵液中的高級(jí)醇和酯類物質(zhì)（見(jiàn)圖2），如苯乙醇、異丁醇、正丙醇、甲硫醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯酯、乙酸己酯. 表1給出了部分氨基酸及其相應(yīng)的高級(jí)醇和酯類物質(zhì)。4VG、4VP和前面提到的芳香物質(zhì)決定著小麥啤酒的風(fēng)味和口感。表1：部分氨基酸及其相應(yīng)的高級(jí)醇和酯氨基酸高級(jí)醇酯亮氨酸異戊醇乙酸異戊酯異亮氨酸戊醇乙

5、酸戊酯苯丙氨酸苯乙醇乙酸苯乙酯蛋氨酸甲硫醇乙酸甲硫酯除考慮麥芽水分、發(fā)芽溫度、時(shí)間、干燥溫度對(duì)糖化過(guò)程的影響，本文旨在尋找最佳的糖化條件，提供最適的酶解條件，使阿魏酸、對(duì)香豆酸、氨基酸最大程度溶解，同時(shí)減少苯丙烯酸的產(chǎn)生。此次研究中，主要考慮糖化溫度、pH、時(shí)間及麥芽色度。試驗(yàn)材料與方法l 試驗(yàn)材料所有分析物和試劑都是分析級(jí)或色譜級(jí)，其中，苯丙烯酸、對(duì)香豆酸、甲醇、冰乙醇由Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany)提供。l 酚酸含量測(cè)定方法如Schwarz等發(fā)現(xiàn)，使用安捷倫高效液相色譜（Agilent 1100 HPLC-DAD ）檢測(cè)苯丙烯酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸。使用 A

6、ppliChrom OTU Li-poMare C18 (250 mm * 4.6 mm *5 pm )(AppliChrom.Oranienburg)檢測(cè)各類酚酸。 通過(guò)不同的紫外檢測(cè)波段最終區(qū)分苯丙烯酸（280nm），對(duì)香豆酸、阿魏酸(312nm)。l 氨基酸含量測(cè)定方法使用EZ （Phenomenex,Aschaffenburg.German）和GC-FID(Hewlett-Packard 5890)分析樣品中游離氨基酸。l 糖化溫度影響的分析方法采用以下試驗(yàn)來(lái)研究糖化溫度對(duì)酚酸和氨基酸浸出的影響：分別磨碎40g比爾森啤酒麥芽和裸小麥芽，加入300ml熱水糖化。依據(jù)Vanbeneden

7、等人的研究，在 25到80之間，進(jìn)行恒溫糖化，pH值設(shè)定為5.4。樣品分別處理30,60,120及180分鐘，然后立即使用100ml冰水冷卻，5ml冰醇酸調(diào)酸滅酶。調(diào)整溶液到500g后，離心5分鐘（10，000rpm），上清液冷藏于-18待分析。l 糖化pH影響的分析方法添加300ml水后，使用1N氫氧化鈉溶液或1N鹽酸溶液將料液pH分別調(diào)至4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8，于45下分別糖化60分鐘。l 糖化時(shí)間影響的分析方法45，pH5.4條件下，樣品分別糖化10,20,30,45,60,75,90,105,120

8、,180,240和 300分鐘。l 不同麥芽和原料影響的分析方法分析不同色度（1.8-300EBC）著色麥芽和各種糧食（大麥、小麥、黑麥）對(duì)酚酸、氨基酸溶解的影響。麥芽由Weyermann (德國(guó),班貝克)提供。45，pH5.4條件下，樣品分別糖化60分鐘。l 統(tǒng)計(jì)分析所有試驗(yàn)至少重復(fù)兩次。每一組試驗(yàn)麥汁在同一水平下進(jìn)行分析，結(jié)果用偏差表示。結(jié)果與討論l 糖化溫度的影響為研究糖化溫度對(duì)麥汁（小麥麥芽：哈雷麥芽=50%：50%）酚酸（苯丙烯酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸）和氨基酸（丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸）溶解的影響， 樣品在25-80間進(jìn)行恒溫試驗(yàn)。從圖3可以看出糖化溫

9、度對(duì)阿魏酸溶解的影響。整體來(lái)看，45時(shí)阿魏酸溶解量最大，這與目前的研究結(jié)論一致（40、43、45）。考慮糖化時(shí)間（30分鐘、60分鐘），50時(shí)阿魏酸溶解量最大。25-60間，糖化時(shí)間越長(zhǎng)，阿魏酸溶解量越大。65以上，糖化時(shí)間對(duì)阿魏酸溶解沒(méi)有顯著影響，因?yàn)檫@個(gè)溫度范圍內(nèi)，大多數(shù)阿魏酸降解酶已失活。Vanbeneden和McMurrough等人也有類似的發(fā)現(xiàn)。從圖4可以看出糖化溫度對(duì)苯丙烯酸相似的影響趨勢(shì)。45和50時(shí)，苯丙烯酸溶解量最大。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，60以內(nèi)，糖化時(shí)間越長(zhǎng)，物質(zhì)浸出越多；65以上，糖化時(shí)間對(duì)物質(zhì)的浸出沒(méi)有顯著作用。圖5中沒(méi)有顯示對(duì)香豆酸最佳的溶解溫度。在30-35、45-50

10、均出現(xiàn)對(duì)香豆酸溶解峰值。與苯丙烯酸、阿魏酸相比，隨著糖化時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)香豆酸溶解量并沒(méi)有增加。糖化時(shí)間超過(guò)120分鐘，延長(zhǎng)糖化時(shí)間可以降低對(duì)香豆酸的溶解。65以上，隨著溫度的上升，對(duì)香豆酸溶解量明顯降低。圖6顯示，糖化溫度50時(shí)，氨基酸濃度出現(xiàn)峰值。檢測(cè)的氨基酸中，亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、丙氨酸峰值較高（c200mg/l）。而蛋氨酸峰值最低（芳香物質(zhì)甲硫醇和甲硫代丙醛的代謝前體，這兩種物質(zhì)風(fēng)味閾值非常低）。l 糖化pH的影響在45下，糖化60分鐘，研究不同pH（4.2-6.8）對(duì)酚酸和氨基酸溶解的影響。從圖7可以看出pH對(duì)阿魏酸、對(duì)香豆酸、苯丙烯酸溶解的影響。對(duì)阿魏酸來(lái)說(shuō)，最適pH為5.4-

11、6.6。Vanbeneden等人研究發(fā)現(xiàn)最佳pH 為5.8，也有研究表明相關(guān)酶的最適pH在一定范圍內(nèi)。對(duì)對(duì)香豆酸來(lái)說(shuō)，出現(xiàn)兩個(gè)最適pH范圍： 4.4-4.6、5.8-6.0。對(duì)苯丙烯酸來(lái)說(shuō)，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，醪液越接近中性，苯丙烯酸的溶解量越大。從圖8可以看出，pH值5.2-5.4時(shí)，氨基酸含量出現(xiàn)峰值。這與目前研究的最適pH5.2是一致的。從圖6也可以得到相似的結(jié)論。l 糖化時(shí)間的影響圖9,10顯示不同糖化時(shí)間對(duì)酚酸和氨基酸溶解的影響，研究從10分鐘持續(xù)到300分鐘，使用小麥芽和大麥芽。圖表9顯示糖化時(shí)間對(duì)阿魏酸、對(duì)香豆酸、苯丙烯酸溶解量的影響。對(duì)阿魏酸來(lái)說(shuō)，糖化時(shí)間與阿魏酸溶解量呈獻(xiàn)性關(guān)系（R

12、2=0.98），10分鐘時(shí)，阿魏酸含量0.7 mg/l,300分鐘時(shí)，阿魏酸含量為7.8 mg/l。與阿魏酸相似，整個(gè)糖化過(guò)程中，苯丙烯酸含量呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)。但240分鐘后，溶解量維持在相近水平（0.4 mg/l）。105分鐘到120分鐘，對(duì)香豆酸出現(xiàn)峰值（0.9 mg/l），然后不斷降低直至糖化結(jié)束。從圖5也可看出，120分鐘后，對(duì)香豆酸溶解量快速降低。從圖10 可以看出，隨著糖化時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸溶解量不斷增加。120分鐘后，氨基酸已基本溶解。這與糖化溫度、pH影響的研究結(jié)論是一致的。l 著色麥芽和不同原料的影響不同原料（小麥、大麥、黑麥）和著色麥芽（1.8-430EBC）中酚酸和氨基酸含

13、量是不同的。45下分別糖化60分鐘，來(lái)研究不同原料及麥芽對(duì)阿魏酸、對(duì)香豆酸、苯丙烯酸溶解的影響（圖11）。所有樣品中，黑麥麥芽樣品中阿魏酸和對(duì)香豆酸溶解度最高，但苯丙烯酸的溶解量與其他樣品相近。從大麥綠麥芽到比爾森麥芽，所有酚酸含量呈上升趨勢(shì)。與小麥麥芽和比爾森麥芽相比，大麥制成的麥芽樣品酚酸含量偏高。與淺色小麥麥芽相比，深色小麥麥芽樣品中酚酸含量偏低。整體來(lái)講，色度2-74EBC，麥芽色度與酚酸含量沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)性。此外，色度超過(guò)91 EBC樣品中，沒(méi)有檢測(cè)到酚酸物質(zhì)，這與Inns 等人的研究是一致的，他們也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)麥芽干燥溫度與酚酸明顯的關(guān)聯(lián)性。圖12顯示不同原料及麥芽對(duì)氨基酸的影響趨勢(shì)。

14、從大麥到綠麥芽再到比爾森麥芽，氨基酸溶解量趨勢(shì)與酚酸相似。與酚酸相比，黑麥麥芽樣品中各類氨基酸溶解量與深色小麥麥芽樣品相似。因而，麥芽色度與氨基酸含量沒(méi)有明顯的關(guān)聯(lián)性，如特種麥芽Caraamber色度高，氨基酸溶解量也高。其它特種麥芽中也有少量氨基酸溶解。與pH、時(shí)間、溫度影響試驗(yàn)相同，在此試驗(yàn)過(guò)程中，丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸被大量檢出。結(jié)論通過(guò)試驗(yàn)研究糖化pH、時(shí)間、溫度對(duì)酚酸及氨基酸溶解的影響，尋找增加芳香前體物質(zhì)如阿魏酸、對(duì)香豆酸溶解量，同時(shí)降低苯丙烯酸含量的最適糖化條件。同阿魏酸、對(duì)香豆酸一樣，苯丙烯酸在45-50糖化溫度下也可溶解。延長(zhǎng)糖化時(shí)間可以促使這三種物質(zhì)溶解。因此，相

15、關(guān)參數(shù)的確定是相當(dāng)困難的。試驗(yàn)證實(shí)，隨著pH值的增加，苯丙烯酸的溶解度不斷增加。將麥汁調(diào)酸至pH值5.2-5.4，可使苯丙烯酸的溶解度降低。在這個(gè)pH值范圍內(nèi)，游離氨基酸溶解量增加，這些氨基酸是構(gòu)成芳香物質(zhì)高級(jí)醇和酯類的前體物質(zhì)，但阿魏酸和對(duì)香豆酸的溶解度有微量降低（見(jiàn)表2）。目前研究表明，前體物質(zhì)的數(shù)量與芳香物質(zhì)的量沒(méi)有必然聯(lián)系，酵母菌株、發(fā)酵溫度、進(jìn)一步生產(chǎn)過(guò)程都顯著影響小麥啤酒風(fēng)味。如在酯類形成過(guò)程中，含氮物質(zhì)濃度，可發(fā)酵糖，脂類物質(zhì)也有重要作用。且芳香物質(zhì)對(duì)酒體風(fēng)味的影響取決于其嗅覺(jué)閾值。表2: 酚酸和氨基酸溶解最適糖化條件時(shí)間，min溫度，pH值阿魏酸300455.4-6.6對(duì)香豆酸105-20