生物工程下游技術(shù)第四章沉淀法

1、生物分離過(guò)程的一般流程生物分離過(guò)程的一般流程原料液原料液細(xì)胞分離細(xì)胞分離( (離心，過(guò)濾離心，過(guò)濾) )細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞胞內(nèi)產(chǎn)物細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎碎片分離碎片分離清液胞外產(chǎn)物清液胞外產(chǎn)物粗分離粗分離( (鹽析、萃取、超過(guò)濾等鹽析、萃取、超過(guò)濾等) )純化純化( (層析、電泳層析、電泳) )脫鹽脫鹽( (凝膠過(guò)濾、超過(guò)濾凝膠過(guò)濾、超過(guò)濾) )濃縮濃縮( (超過(guò)濾超過(guò)濾) )精制精制( (結(jié)晶、干燥結(jié)晶、干燥) )溶解溶解( (加鹽酸胍、脲加鹽酸胍、脲) )復(fù)性復(fù)性 與化學(xué)產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要與化學(xué)產(chǎn)品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點(diǎn)：特點(diǎn)： 生物材料的組

2、成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千生物材料的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。種化合物。 許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長(zhǎng)。步驟繁多，流程長(zhǎng)。 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述許多生物大分子一旦離開(kāi)了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易許多生物大分子一旦離開(kāi)了生物體內(nèi)的環(huán)境時(shí)就極易失活，因此分離過(guò)程中如何防止其失活，就是生物失活，因此分離過(guò)程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。大分子提取制備最困難之處。生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的，溫度、pHpH值、離

3、子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜值、離子強(qiáng)度等各種參數(shù)對(duì)溶液中各種組成的綜合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷。合影響，很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷?；靖拍罨靖拍?通過(guò)加入某種試劑或改變?nèi)芤簵l件，使生化產(chǎn)物以固體通過(guò)加入某種試劑或改變?nèi)芤簵l件，使生化產(chǎn)物以固體形式（沉淀和晶體）從溶液中沉降析出的分離純化技術(shù)稱為形式（沉淀和晶體）從溶液中沉降析出的分離純化技術(shù)稱為固相析出技術(shù)。固相析出技術(shù)。 結(jié)晶法：在固相析出過(guò)程中，析出物為晶體時(shí)稱為結(jié)晶結(jié)晶法：在固相析出過(guò)程中，析出物為晶體時(shí)稱為結(jié)晶法。法。 沉淀法：在固相析出過(guò)程中，析出物為無(wú)定形固體時(shí)則沉淀法：在固相析出過(guò)程中，析出物為無(wú)定形固體時(shí)則稱為沉淀法。常用

4、的沉淀法主要有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法稱為沉淀法。常用的沉淀法主要有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法和等電點(diǎn)沉淀法等。和等電點(diǎn)沉淀法等。 沉淀法（即溶解度法）操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不僅用于實(shí)驗(yàn)室沉淀法（即溶解度法）操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不僅用于實(shí)驗(yàn)室中，也用于某些生產(chǎn)目的的制備過(guò)程，是分離純化生物大分子，中，也用于某些生產(chǎn)目的的制備過(guò)程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。特別是制備蛋白質(zhì)和酶時(shí)最常用的方法。 通過(guò)沉淀達(dá)到濃縮的目的，或者通過(guò)沉淀，固液分相通過(guò)沉淀達(dá)到濃縮的目的，或者通過(guò)沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉積在固體中的非必要成分；后，除去留在液相或沉積在固體中的非必要成分；

5、沉淀可以將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步沉淀可以將已純化的產(chǎn)品由液態(tài)變成固態(tài)，加以保存或進(jìn)一步處理。沉淀方法用于分離純化是有選擇性的，即有選擇地沉淀處理。沉淀方法用于分離純化是有選擇性的，即有選擇地沉淀雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分。雜質(zhì)或有選擇地沉淀所需成分。沉淀分離在生物分離過(guò)程中應(yīng)用相當(dāng)廣泛。一般情況下，沉淀沉淀分離在生物分離過(guò)程中應(yīng)用相當(dāng)廣泛。一般情況下，沉淀分離方法在生物下游加工過(guò)程中通常作為初級(jí)分離技術(shù)加以使分離方法在生物下游加工過(guò)程中通常作為初級(jí)分離技術(shù)加以使用，但在實(shí)際過(guò)程中也有僅通過(guò)沉淀分離得到目標(biāo)產(chǎn)品的工業(yè)用，但在實(shí)際過(guò)程中也有僅通過(guò)沉淀分離得到目標(biāo)產(chǎn)品的工業(yè)實(shí)例

6、。實(shí)例。 根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的目的，不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與目的，不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)，溶劑組分的改變或溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱募尤肽承┏恋韯┮约案淖內(nèi)芤旱膒HpH值、離子強(qiáng)度和極性值、離子強(qiáng)度和極性都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。都會(huì)使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。 在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是：在

7、生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是： 中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。化。 有機(jī)溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及有機(jī)溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物生物小分子小分子的分離純化。的分離純化。 選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定除去某些不耐熱的和在一定pHpH值下易變性的雜蛋白。值下易變性的雜蛋白。 等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉等電點(diǎn)沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，

8、多與其他方法結(jié)合使用。淀，但此法單獨(dú)應(yīng)用較少，多與其他方法結(jié)合使用。 有機(jī)聚合物沉淀：有機(jī)聚合物沉淀： 是發(fā)展較快的一種新方法，是發(fā)展較快的一種新方法， 主要使主要使用用PEGPEG聚乙二醇（聚乙二醇（Polyethyene glycolPolyethyene glycol）作為沉淀劑。）作為沉淀劑。n蛋白質(zhì)組成蛋白質(zhì)組成 20 20種氨基酸構(gòu)成的兩性高分子電解質(zhì)，包括疏水性氨基種氨基酸構(gòu)成的兩性高分子電解質(zhì)，包括疏水性氨基酸和親水性氨基酸酸和親水性氨基酸n蛋白質(zhì)折疊趨勢(shì)蛋白質(zhì)折疊趨勢(shì) 疏水性氨基酸：向內(nèi)部折疊的趨勢(shì)疏水性氨基酸：向內(nèi)部折疊的趨勢(shì) 親水性氨基酸：分布于蛋白質(zhì)外表面的趨勢(shì)親水性氨

9、基酸：分布于蛋白質(zhì)外表面的趨勢(shì) n結(jié)果結(jié)果 在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中仍會(huì)有部分疏水性氨基酸殘基暴在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中仍會(huì)有部分疏水性氨基酸殘基暴露于表面，在蛋白質(zhì)表面形成一定的疏水區(qū)露于表面，在蛋白質(zhì)表面形成一定的疏水區(qū)第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)的表面特性蛋白質(zhì)的表面特性n蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。親水區(qū)和疏水區(qū)構(gòu)成。n蛋白質(zhì)的溶解行為是一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)象以蛋白質(zhì)的溶解行為是一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)，由其組成、構(gòu)象以及分子周圍的環(huán)境所決定。及分子周圍的環(huán)境所決定。n一般而言，小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的大分子蛋白一般而言，

10、小分子蛋白質(zhì)比起在化學(xué)上類似的大分子蛋白質(zhì)更易溶解。質(zhì)更易溶解。防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障蛋白質(zhì)周圍的水化層（蛋白質(zhì)周圍的水化層（hydration shell)hydration shell) 可以使蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液?？梢允沟鞍踪|(zhì)形成穩(wěn)定的膠體溶液。蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層）蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。（存在雙電層） 膠體的定義膠體的定義n膠體是一種尺寸在膠體是一種尺寸在1 1100 nm100 nm以至以至1000 1000 nmnm的分散體。它既非大塊固體，又不是的分散體。它既非大塊固體，又不是分子分散的液體，而是具有兩相的微不分子分散的液體，而

11、是具有兩相的微不均勻分散體系。均勻分散體系。 -被遺忘了尺寸的世界Wilhelm Friedrich Ostwald (1853 1932) 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性n蛋白質(zhì)可以看作是一個(gè)表面分布有正、負(fù)電荷的球蛋白質(zhì)可以看作是一個(gè)表面分布有正、負(fù)電荷的球體，這種正、負(fù)電荷是由氨基和羧基的離子化形成體，這種正、負(fù)電荷是由氨基和羧基的離子化形成的，換句話說(shuō)，該球體是帶有均衡電荷分布的膠體的，換句話說(shuō)，該球體是帶有均衡電荷分布的膠體顆粒。因此，蛋白質(zhì)的沉淀，實(shí)際上與膠體顆粒的顆粒。因此，蛋白質(zhì)的沉淀，實(shí)際上與膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似。凝聚和絮凝現(xiàn)象相似。靜電斥力靜電斥力吸引

12、力吸引力蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/ /膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似膠體顆粒的凝聚和絮凝現(xiàn)象相似n蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附蛋白質(zhì)粒子在水溶液中是帶電的，帶電的原因主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。因溶液是電中性的，水溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離。因溶液是電中性的，水中應(yīng)有等當(dāng)量的反離子存在。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中中應(yīng)有等當(dāng)量的反離子存在。蛋白質(zhì)表面的電荷與溶液中反離子的電荷構(gòu)成雙電層。反離子的電荷構(gòu)成雙電層。吸引力n顆粒間的相互作用顆粒間的相互作用n顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。nVan der Waals Van der Wa

13、als 力力nKeeson Keeson 引力（偶極力）引力（偶極力）nDebye Debye 引力引力 （誘導(dǎo)力）（誘導(dǎo)力）nLondon London 引力引力 （色散力）是最重要的一種引力，因?yàn)樗校ㄉ⒘Γ┦亲钪匾囊环N引力，因?yàn)樗蟹肿佣际强梢员粯O化的，所以它是普遍存在的。分子都是可以被極化的，所以它是普遍存在的。DLVODLVO理論理論n顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。在低離子強(qiáng)度時(shí)，顆粒距離處在顆粒間的相互作用的位能取決于離子強(qiáng)度。在低離子強(qiáng)度時(shí)，顆粒距離處在中間狀態(tài)，雙電層斥力占優(yōu)勢(shì)，可看為一個(gè)凝聚的勢(shì)壘；在高離子強(qiáng)度時(shí)，中間狀態(tài)，雙電層斥力占優(yōu)勢(shì)，可看為一個(gè)凝聚的勢(shì)壘；

14、在高離子強(qiáng)度時(shí)，吸引力超過(guò)排斥力，相互間的總位能表現(xiàn)為吸引位能。吸引力超過(guò)排斥力，相互間的總位能表現(xiàn)為吸引位能。沉淀策略及方法沉淀策略及方法n策略策略 破壞蛋白質(zhì)周圍的水化層破壞蛋白質(zhì)周圍的水化層 降低雙電層厚度（降低雙電層厚度（電位）電位）n沉淀方法沉淀方法 改變?nèi)芤焊淖內(nèi)芤簆H值值 加入無(wú)機(jī)鹽或改變無(wú)機(jī)鹽種類加入無(wú)機(jī)鹽或改變無(wú)機(jī)鹽種類 加入水溶性有機(jī)溶劑加入水溶性有機(jī)溶劑 添加脫水劑添加脫水劑 定義：定義：n蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中溶蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為“鹽析鹽析”。第三節(jié)第三節(jié) 鹽析法鹽析法兩種現(xiàn)象：兩種現(xiàn)象：鹽溶：低鹽情

15、況，鹽離子強(qiáng)度鹽溶：低鹽情況，鹽離子強(qiáng)度的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大。的增高，蛋白質(zhì)溶解度增大。鹽析：高鹽，鹽離子強(qiáng)度增加，鹽析：高鹽，鹽離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)溶解度減小。蛋白質(zhì)溶解度減小。應(yīng)用：應(yīng)用：n蛋白質(zhì)和酶分離提純蛋白質(zhì)和酶分離提純n多肽、多糖和核酸也可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離多肽、多糖和核酸也可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離q20204040飽和度的硫酸銨可以使許多病毒沉飽和度的硫酸銨可以使許多病毒沉淀淀q4343飽和度的硫酸銨可以使飽和度的硫酸銨可以使DNADNA和和rRNArRNA沉淀，沉淀，而而tRNAtRNA保留在上清。保留在上清。一、鹽析法的原理及特點(diǎn)一、鹽析法的原理及特點(diǎn)原理原理n形成離

16、子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥形成離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，排斥作用減弱而能相互靠攏，聚集起來(lái)。作用減弱而能相互靠攏，聚集起來(lái)。n中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了中性鹽的親水性比蛋白質(zhì)大，使蛋白質(zhì)脫去了水化膜，使其沉淀。水化膜，使其沉淀。 Cohn方程式n現(xiàn)在常用現(xiàn)在常用 CohnCohn經(jīng)驗(yàn)式來(lái)表示蛋白質(zhì)的溶解度與鹽的濃度之間的關(guān)系：經(jīng)驗(yàn)式來(lái)表示蛋白質(zhì)的溶解度與鹽的濃度之間的關(guān)系：n S= S= s s n式中式中SS蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度，g/L;g/L;n I I一離子強(qiáng)度等于一離子強(qiáng)度等于 I=1/2m I=1/2mi iz zi i2 2; ;n m mi

17、i離子離子 i i的摩爾濃度；的摩爾濃度；n Zi Zi所帶電荷；所帶電荷；n n常數(shù)，與鹽的種類無(wú)關(guān)，但與溫度、常數(shù)，與鹽的種類無(wú)關(guān)，但與溫度、pHpH和蛋白質(zhì)種類有關(guān)和蛋白質(zhì)種類有關(guān); ;nKsKs鹽析常數(shù)，與溫度和鹽析常數(shù)，與溫度和PHPH無(wú)關(guān)，但與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)。無(wú)關(guān)，但與蛋白質(zhì)和鹽的種類有關(guān)。用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法用鹽析法分離蛋白質(zhì)的二種方法在一定的在一定的 pH pH值及溫度條件下，改變鹽的濃度（即離子值及溫度條件下，改變鹽的濃度（即離子強(qiáng)度）達(dá)到沉淀的目的，稱為強(qiáng)度）達(dá)到沉淀的目的，稱為“s s”分級(jí)鹽析法。分級(jí)鹽析法。（KsKs鹽析：固定鹽析：固定pH, pH, 溫

18、度，改變鹽濃度）溫度，改變鹽濃度）在一定的離子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤旱脑谝欢ǖ碾x子強(qiáng)度下，改變?nèi)芤旱膒HpH值及溫度，達(dá)值及溫度，達(dá)到沉淀的目的，稱為到沉淀的目的，稱為“”分級(jí)鹽析法。分級(jí)鹽析法。（鹽析：固定離子強(qiáng)度，改變鹽析：固定離子強(qiáng)度，改變pHpH及溫度。）及溫度。） 成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。 操作簡(jiǎn)單、安全。操作簡(jiǎn)單、安全。 對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用，不易引起蛋對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用，不易引起蛋白質(zhì)變性白質(zhì)變性 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)鹽析法分辨率不高，適合于生化物質(zhì)粗提純階鹽析法分辨率不高，適合于生化物質(zhì)粗提純階段，需和其它方法交替使用。段，需和其

19、它方法交替使用。二、影響鹽析的因素二、影響鹽析的因素（一）離子強(qiáng)度和類型（一）離子強(qiáng)度和類型n一般說(shuō)來(lái)，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在進(jìn)行一般說(shuō)來(lái)，離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低。在進(jìn)行分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。分離的時(shí)候，一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。每一組分被鹽析出來(lái)后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾或冷凍離心收集，再在每一組分被鹽析出來(lái)后，經(jīng)過(guò)過(guò)濾或冷凍離心收集，再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽溶液中逐漸提高中性鹽的飽和度，使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來(lái)。析出來(lái)。 n鹽析能力：半徑小的高價(jià)離子在鹽析時(shí)的作用較強(qiáng)，鹽析能力：半徑小的高價(jià)離子在鹽析時(shí)的作用

20、較強(qiáng)，陰離子的鹽析效果比陽(yáng)離子好，尤其以高價(jià)陰離子陰離子的鹽析效果比陽(yáng)離子好，尤其以高價(jià)陰離子更為明顯。更為明顯。n PO4 3-SO42-CH3COO-Cl-NO3-I-nNH4+K+Na+Li+ n鹽析用鹽要考慮幾個(gè)因素：常用硫酸銨鹽析用鹽要考慮幾個(gè)因素：常用硫酸銨( (二）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類的影響二）溶質(zhì)（蛋白質(zhì)等）種類的影響（三）蛋白質(zhì)濃度的影響（三）蛋白質(zhì)濃度的影響 在相同的鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃在相同的鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易沉淀，但蛋白質(zhì)的濃度愈度越大越易沉淀，但蛋白質(zhì)的濃度愈高，其它蛋白質(zhì)的共沉作用也愈強(qiáng)，高，其它蛋白質(zhì)的共沉作用也愈強(qiáng)，從而使分辨率降低，從而使分辨率降低

21、，一般常將蛋白質(zhì)濃度控制在一般常將蛋白質(zhì)濃度控制在2 23 3為宜。相當(dāng)于為宜。相當(dāng)于25 mg/mL25 mg/mL30mg/mL30mg/mL。（四）溫度的影響：（四）溫度的影響： 溫度的變化會(huì)影響溫度的變化會(huì)影響 值。在值。在無(wú)鹽或稀鹽溶液中，大多數(shù)無(wú)鹽或稀鹽溶液中，大多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度是隨溫度升高蛋白質(zhì)溶解度是隨溫度升高而增大的，但在而增大的，但在高鹽溶液中高鹽溶液中常相反常相反。 對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在0044下操下操作，以避免活力喪失。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、作，以避免活力喪失。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（肌紅蛋白

22、、清蛋白）在較高的溫度（2525）比）比0 0時(shí)時(shí)溶解度低，更容易鹽析。溶解度低，更容易鹽析。（五）（五）PHPH的影響：的影響： 蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的溶解度就越大。改變它的溶解度就越大。改變pHpH值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，因而就改變了蛋白質(zhì)的溶解因而就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。度。在等電點(diǎn)處溶解度?。ㄔ诘入婞c(diǎn)處溶解度?。?值最?。?。值最小）。 因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，pHpH值常選在該蛋白質(zhì)值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近的等電點(diǎn)附近三、鹽析常用的鹽三、鹽析常用的鹽 常用的鹽析用鹽主要有硫酸銨、硫酸鈉、常用的鹽析用鹽

23、主要有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀等。氯化鈉、磷酸鈉、磷酸鉀等。 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4 最常用：最常用： 溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0 044）進(jìn)行。）進(jìn)行。由下表可以看到，（由下表可以看到，（NH4NH4）2SO42SO4在在00時(shí)仍有時(shí)仍有70.670.6的溶解的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類： 幾種鹽在不同

24、溫度下的溶解度（克幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100/100毫升水）毫升水）02080100(NH4)2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去步就可以除去7575的雜蛋白，純度提高了四倍。的雜蛋白，純度提高了四倍。 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用酶或蛋白質(zhì)用2 23mol/L3mol/L的（的（NH4NH4）2SO42SO4保存可達(dá)數(shù)年保

25、存可達(dá)數(shù)年之久。之久。 價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。n但硫酸銨具腐蝕性且緩沖能力差，飽和溶液的但硫酸銨具腐蝕性且緩沖能力差，飽和溶液的pHpH值在值在4.54.55.55.5之間，使用時(shí)多用濃氨水調(diào)整到之間，使用時(shí)多用濃氨水調(diào)整到pH7pH7左右。左右。四、鹽析操作（以硫酸銨為例）四、鹽析操作（以硫酸銨為例） 鹽析時(shí)，將鹽加入到溶液中有兩種方式：鹽析時(shí)，將鹽加入到溶液中有兩種方式：（1 1）加硫酸銨的飽和溶液：在實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中，或）加硫酸銨的飽和溶液：在實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模生產(chǎn)中，或(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 濃度不需太高時(shí)，可采用這種方式，它可防止?jié)?/p>

26、度不需太高時(shí)，可采用這種方式，它可防止溶液局部過(guò)濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋。溶液局部過(guò)濃，但加量較多時(shí)，料液會(huì)被稀釋。（2 2）直接加固體硫酸銨：工業(yè)上常采用這種方法，加入）直接加固體硫酸銨：工業(yè)上常采用這種方法，加入速度不能太快，應(yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚢?，使其完全溶速度不能太快，?yīng)分批加入，并充分?jǐn)嚢?，使其完全溶解和防止局部濃度過(guò)高；解和防止局部濃度過(guò)高； 常用常用“飽和度飽和度”來(lái)表征硫酸銨在溶液中來(lái)表征硫酸銨在溶液中的最終濃度，的最終濃度，2525時(shí)時(shí)(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4的飽和濃度的飽和濃度為為4.1 mol4.1 molL L，定義它為，定義它為100%100

27、%飽和度。飽和度。 鹽析曲線的制作鹽析曲線的制作 如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒(méi)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可如果要分離一種新的蛋白質(zhì)和酶，沒(méi)有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體以借鑒，則應(yīng)先確定沉淀該物質(zhì)的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下：操作方法如下： 取已定量測(cè)定蛋白質(zhì)或酶的活性與濃度的待分離樣品取已定量測(cè)定蛋白質(zhì)或酶的活性與濃度的待分離樣品溶液，冷至溶液，冷至0055，調(diào)至該蛋白質(zhì)穩(wěn)定的，調(diào)至該蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pHpH值。值。 計(jì)算飽和度達(dá)到計(jì)算飽和度達(dá)到20%-100%20%-100%所需加入的硫酸銨量，邊所需加入的硫酸銨量，邊攪拌邊加入，放置攪拌邊加入，放置1h1h以上，使沉淀達(dá)

28、到平衡以上，使沉淀達(dá)到平衡鹽析操作鹽析操作- -溶解度曲線確定溶解度曲線確定離心分離離心分離沉淀物并重沉淀物并重新溶解測(cè)定新溶解測(cè)定其中總蛋白其中總蛋白和目標(biāo)蛋白和目標(biāo)蛋白的濃度的濃度 以飽和度以飽和度為橫坐標(biāo)，為橫坐標(biāo)，上清液中總上清液中總蛋白和目標(biāo)蛋白和目標(biāo)蛋白濃度為蛋白濃度為縱坐標(biāo)，得縱坐標(biāo)，得到蛋白質(zhì)溶到蛋白質(zhì)溶解度曲線解度曲線 第三節(jié)第三節(jié) 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法n定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶定義：向水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。純化方法。一、有機(jī)溶劑沉淀法的原理和特點(diǎn)一、有

29、機(jī)溶劑沉淀法的原理和特點(diǎn)n原理原理1 1）加入有機(jī)溶劑后，會(huì)使水溶液的介電常數(shù)降低）加入有機(jī)溶劑后，會(huì)使水溶液的介電常數(shù)降低 ，導(dǎo)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的靜電引力增加，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生致蛋白質(zhì)分子之間的靜電引力增加，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集沉淀。聚集沉淀。 2 2）由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋）由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。膜，因而發(fā)生沉淀作用。特點(diǎn)特點(diǎn) n分辨率高于鹽析；分辨率高于鹽析；n乙醇等有機(jī)溶劑沸點(diǎn)低，易揮發(fā)除去

30、，不會(huì)殘留于成品中，乙醇等有機(jī)溶劑沸點(diǎn)低，易揮發(fā)除去，不會(huì)殘留于成品中，產(chǎn)品更純凈；產(chǎn)品更純凈；n沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易。沉淀物與母液間的密度差較大，分離容易。n但有機(jī)溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)等生物大分子變性，操作需在但有機(jī)溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)等生物大分子變性，操作需在低溫下進(jìn)行；需要耗用大量有機(jī)溶劑，成本較高低溫下進(jìn)行；需要耗用大量有機(jī)溶劑，成本較高; ;有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑一般易燃易爆，所以貯存比較困難或麻煩。一般易燃易爆，所以貯存比較困難或麻煩。二、二、 有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算n用于生化制備的有機(jī)溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉用于生化制備的有機(jī)溶劑的

31、選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。 進(jìn)行沉淀操作時(shí)，欲使溶液達(dá)到一定的有機(jī)溶劑濃度，進(jìn)行沉淀操作時(shí)，欲使溶液達(dá)到一定的有機(jī)溶劑濃度，需要加入的有機(jī)溶劑的濃度和體積可按下式計(jì)算：需要加入的有機(jī)溶劑的濃度和體積可按下式計(jì)算： V = V0 (S2 V = V0 (S2 S1) S1) (100(100S2)S2) 式中：式中： V = V = 需加入需加入100100濃度有機(jī)溶劑的體積濃度有機(jī)溶劑的體積 V0 = V0 = 原溶液體

32、積原溶液體積 S1 = S1 = 原溶液中有機(jī)溶劑的濃度原溶液中有機(jī)溶劑的濃度 S2 = S2 = 所要求達(dá)到的有機(jī)溶劑的濃度所要求達(dá)到的有機(jī)溶劑的濃度 100100是指加入的有機(jī)溶劑濃度為是指加入的有機(jī)溶劑濃度為100100，如所加入的有機(jī)溶劑的濃度為，如所加入的有機(jī)溶劑的濃度為9595，上式的，上式的(100(100S2) S2) 項(xiàng)應(yīng)改為項(xiàng)應(yīng)改為 (95 (95S2)S2) 。n上式的計(jì)算由于未考慮混溶后體積的變化和溶劑的上式的計(jì)算由于未考慮混溶后體積的變化和溶劑的揮發(fā)情況，實(shí)際上存在一定的誤差。有時(shí)為了獲得揮發(fā)情況，實(shí)際上存在一定的誤差。有時(shí)為了獲得沉淀而不著重于進(jìn)行分離，可用溶液體積

33、的倍數(shù)：沉淀而不著重于進(jìn)行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機(jī)溶劑，如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機(jī)溶劑，來(lái)進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀。來(lái)進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀。 三、常用的有機(jī)溶劑三、常用的有機(jī)溶劑 常用于生物大分子沉淀的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮和甲醇等。其常用于生物大分子沉淀的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮和甲醇等。其中乙醇是最常用的沉淀劑，因?yàn)樗哂谐恋碜饔脧?qiáng)、沸點(diǎn)適中、無(wú)中乙醇是最常用的沉淀劑，因?yàn)樗哂谐恋碜饔脧?qiáng)、沸點(diǎn)適中、無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)。毒等優(yōu)點(diǎn)。 四、有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素四、有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素 1 1、溫度、溫度 有機(jī)溶劑與水混合時(shí)，會(huì)放出大量的熱量，使溶有機(jī)溶劑與水混

34、合時(shí)，會(huì)放出大量的熱量，使溶液的溫度顯著升高，從而增加有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的變性作液的溫度顯著升高，從而增加有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用。另外，溫度還會(huì)影響有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀能力，用。另外，溫度還會(huì)影響有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀能力，一般溫度越低，沉淀越完全。因此，在使用有機(jī)溶劑沉淀一般溫度越低，沉淀越完全。因此，在使用有機(jī)溶劑沉淀生物高分子時(shí)，整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行生物高分子時(shí)，整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行 。2 2、pHpH值值 有機(jī)溶劑沉淀適宜的有機(jī)溶劑沉淀適宜的pHpH值，要選擇在樣品穩(wěn)定的值，要選擇在樣品穩(wěn)定的pHpH值值范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶

35、解度最低的pHpH值，通值，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。 3 3、樣品濃度、樣品濃度 樣品較稀時(shí)，將增加有機(jī)溶劑投入量和損耗；樣品太濃樣品較稀時(shí)，將增加有機(jī)溶劑投入量和損耗；樣品太濃會(huì)增加共沉作用會(huì)增加共沉作用 。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初濃度以。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初濃度以0.50.52 2為好，為好，粘多糖則以粘多糖則以1 12 2較合適。較合適。4 4、中性鹽濃度、中性鹽濃度 較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變性。一般在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)中性鹽濃度以性。一般在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)

36、中性鹽濃度以0.010.010.05mol/L0.05mol/L為為好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。好，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化鈉等。 5 5、某些金屬離子、某些金屬離子 一些金屬離子如一些金屬離子如CaCa2+2+、ZnZn2+2+等可與某些成陰離子狀態(tài)等可與某些成陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物溶解度大大降低而不影的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑用量。響生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑用量。利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純利用蛋白質(zhì)沉淀大規(guī)模提純白蛋白與免疫球蛋白的工藝白蛋白與免疫球蛋白的工藝 這一方法是利用

37、蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子與非目這一方法是利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱為條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱為選擇性變性沉淀法。常用的有熱變性、選擇性酸堿變性和選擇性變性沉淀法。常用的有熱變性、選擇性酸堿變性和有機(jī)溶劑變性等。有機(jī)溶劑變性等。第四節(jié)第四節(jié) 選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法 熱變性熱變性 利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保

38、留目的物在溶液中。某些非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最為簡(jiǎn)便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，此方法最為簡(jiǎn)便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子的初期分離純化。通常用于生物大分子的初期分離純化。 n酵母干粉中加入酵母干粉中加入0.066 mol/L0.066 mol/L磷酸氫二鈉溶液，磷酸氫二鈉溶液，3737水水浴保溫浴保溫2 h2 h，室溫?cái)嚢?，室溫?cái)嚢? h3 h，離心收集上清液，升溫至，離心收集上清液，升溫至5555，保溫，保溫20 min20 min后迅速冷卻離心去除熱變性蛋白，后迅速冷卻離心去除熱變性蛋白，上清液中多為熱穩(wěn)定性較高的醇脫氫酶。

39、上清液中多為熱穩(wěn)定性較高的醇脫氫酶。 表面活性劑和有機(jī)溶劑變性表面活性劑和有機(jī)溶劑變性n分離蛋白質(zhì)和酶：對(duì)于表面活性劑和有機(jī)溶劑的敏感分離蛋白質(zhì)和酶：對(duì)于表面活性劑和有機(jī)溶劑的敏感性雜蛋白變性沉淀，而目的物仍留在溶液中。在冰浴性雜蛋白變性沉淀，而目的物仍留在溶液中。在冰浴或冷室中進(jìn)行。或冷室中進(jìn)行。n分離核酸：在核酸提取液中加入氯仿分離核酸：在核酸提取液中加入氯仿- -戊醇或氯仿戊醇或氯仿- -辛醇，振蕩辛醇，振蕩一段時(shí)間、使蛋白質(zhì)在氯仿一段時(shí)間、使蛋白質(zhì)在氯仿- -水的界面上形成沉淀而被除去，水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。核酸仍然留在水溶液中。 在在DNADNA、RNAR

40、NA混合溶液中，用異丙醇選擇性地沉淀混合溶液中，用異丙醇選擇性地沉淀DNADNA，而而RNARNA留在溶液中。留在溶液中。 選擇性酸堿變性選擇性酸堿變性 利用蛋白質(zhì)和酶等對(duì)于溶液中酸堿不同利用蛋白質(zhì)和酶等對(duì)于溶液中酸堿不同pHpH值的穩(wěn)值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀，通常是在分離純化流定性不同而使雜蛋白變性沉淀，通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的一個(gè)分離純化步驟。程中附帶進(jìn)行的一個(gè)分離純化步驟。 等電點(diǎn)沉淀法是利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，等電點(diǎn)沉淀法是利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。

41、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。但是，由于許多蛋白質(zhì)以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。但是，由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，效果不理想。此法分辨率較低，效果不理想。第五節(jié)第五節(jié) 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法在調(diào)節(jié)等電點(diǎn)時(shí)，如果采用鹽在調(diào)節(jié)等電點(diǎn)時(shí)，如果采用鹽 酸、氫氧酸、氫氧化鈉等強(qiáng)酸強(qiáng)堿，要注意防止酶的失活或蛋化鈉等

42、強(qiáng)酸強(qiáng)堿，要注意防止酶的失活或蛋白變性。為了使白變性。為了使pHpH緩慢變動(dòng)，也可用乙酸、緩慢變動(dòng)，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。碳酸等弱酸和碳酸鈉等弱堿。 此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。和分離效果。 此法主要用于在分離純化流程中去除雜此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。蛋白，而不用于沉淀目的物。n（1 1）適用于疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)）適用于疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)n（2 2）中性鹽濃度增大時(shí)，等電點(diǎn)向偏酸方向移動(dòng)，同）中性鹽濃度增大時(shí)，等電點(diǎn)向偏酸方向

43、移動(dòng)，同時(shí)最低溶解度會(huì)有所增大。時(shí)最低溶解度會(huì)有所增大。n（3 3）無(wú)機(jī)酸通常價(jià)格便宜，無(wú)毒）無(wú)機(jī)酸通常價(jià)格便宜，無(wú)毒n（4 4）蛋白質(zhì)對(duì)低）蛋白質(zhì)對(duì)低pH pH 敏感，易失活敏感，易失活等電點(diǎn)沉淀法工業(yè)生產(chǎn)胰島素工業(yè)生產(chǎn)胰島素(pI5.3) ： 胰島素胰島素 pH8 pH8 除去堿性雜蛋白除去堿性雜蛋白 pH3 pH3 除去酸性雜蛋白除去酸性雜蛋白 n堿性磷酸酯酶的堿性磷酸酯酶的pIpI沉淀提?。喊l(fā)酵液調(diào)沉淀提?。喊l(fā)酵液調(diào)pH pH 4.04.0后出現(xiàn)含堿性磷酸酯酶的沉淀物，離心收后出現(xiàn)含堿性磷酸酯酶的沉淀物，離心收集沉淀物。用集沉淀物。用pH 9.0pH 9.0的的0.1 mol/L Tr

44、is-HCl0.1 mol/L Tris-HCl緩緩沖液重新溶解，加入沖液重新溶解，加入202040%40%飽和度的硫酸銨飽和度的硫酸銨分級(jí)，離心收集的沉淀分級(jí)，離心收集的沉淀Tris-HClTris-HCl緩沖液再次沉緩沖液再次沉淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。第六節(jié)第六節(jié) 其它沉淀法其它沉淀法一、有機(jī)聚合物沉淀法一、有機(jī)聚合物沉淀法n有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類重要的沉淀劑，最早應(yīng)有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來(lái)的一類重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來(lái)廣泛用于用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來(lái)廣泛用于核酸和酶的純化。核酸

45、和酶的純化。n應(yīng)用最多的是聚乙二醇應(yīng)用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)( Polyethylene Glycol 4)( Polyethylene Glycol 簡(jiǎn)寫(xiě)為簡(jiǎn)寫(xiě)為 PEG ) PEG )，它的親水性強(qiáng)，溶干水，它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為備中，用的較多的是分子量為200D200D20KD20KD的的 PEG PEG。 nPEGPEG的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子的

46、沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關(guān)，同時(shí)還受離子強(qiáng)度、溶液量有關(guān)，同時(shí)還受離子強(qiáng)度、溶液pHpH和溫和溫度等因素的影響。度等因素的影響。n在一定的在一定的pHpH值下，鹽濃度越高，所需值下，鹽濃度越高，所需PEGPEG時(shí)時(shí)濃度越低，溶液的濃度越低，溶液的pHpH越接近目的物的等電越接近目的物的等電點(diǎn)，沉淀所需點(diǎn)，沉淀所需PEGPEG的濃度越低。在一定范圍的濃度越低。在一定范圍內(nèi)，高分子量和濃度高的內(nèi)，高分子量和濃度高的PEGPEG沉淀的效率高。沉淀的效率高。n理論依據(jù)：理論依據(jù)：n認(rèn)為沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。認(rèn)為沉淀作用是聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。n由于聚合物有較強(qiáng)的親水性