無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證

1、無(wú)菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證1.概述將規(guī)定量的供試品按無(wú)菌檢查法中的薄膜過(guò)濾法進(jìn)行操作 ,并接種小于 100cfu 的試驗(yàn)菌 ,同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照 ,按規(guī)定溫度培養(yǎng) 35 天 ,與各相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照管比較 : 如含供試品各管中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好 ,則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用 ,可按此法進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查 ;如含供試品的任一管中的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng) ,則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用 ,應(yīng)采用增加沖洗量或使用中和劑等方法消除供試品的抑菌作用 ,并再重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。2.驗(yàn)證前提條件供試品的選擇原則 :相同配方 ,不同規(guī)格的制品 ,選擇其中裝量最大的制品進(jìn)行驗(yàn)證。種類相

2、同 ,含量不同的制品 ,選擇含量最高的制品進(jìn)行驗(yàn)證。照此原則 ,多規(guī)格制品按下表選擇供試品進(jìn)行驗(yàn)證。3. 驗(yàn)證方法3.1 菌液制備細(xì)菌菌液制備程序取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的凍干菌種管各一支 ,分別在無(wú)菌操作下打開(kāi) ,以毛細(xì)吸管加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯 ,輕柔吹吸數(shù)次 ,使菌種融化分散后 ,吸出滴入營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上 ,使均勻分布 ,置 3035培養(yǎng) 18h24h。用接種環(huán)取適量第 1 代培養(yǎng)菌苔 ,劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上 ,于 3035培養(yǎng) 18h24h。同法操作 ,培養(yǎng)得第 3 代培養(yǎng)物。取生孢梭菌的凍干菌種管一支 ,在無(wú)菌操作下打開(kāi) ,以毛細(xì)吸管加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯 ,輕柔吹吸

3、數(shù)次 ,使菌種融化分散后 ,吸出滴入胃酶肉肝皰斜面上 ,使均勻分布 ,置3035培養(yǎng) 18h24h。用接種環(huán)取適量第 1 代培養(yǎng)菌苔 ,劃線接種于胃酶肉肝皰斜面上 ,于 30 35培養(yǎng) 18h24h。取生孢梭菌的第二代新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中 ,3035培養(yǎng) 18h24h,得第 3 代培養(yǎng)物。分別取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的第 3 代營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物 ,用 5.0ml 吸管吸取 3.0ml5.0ml 稀釋液加入斜面試管內(nèi) ,反復(fù)吹吸 ,洗下菌苔。隨后用 5.0ml 吸管將洗液移至另一無(wú)菌試管中 ,用電動(dòng)混合器混合 20s,或在手掌上振敲 80 次,以使細(xì)菌懸浮

4、均勻 ,得初步菌懸液。取初步制成的上述菌懸液和生孢梭菌第 3 代新鮮培養(yǎng)物 ,用 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至不高于標(biāo)準(zhǔn)比濁管的濃度 ,即得每 1ml 含菌數(shù)小于 100cfu 驗(yàn)證細(xì)菌菌液。孢子懸液制備程序取白色念珠菌和黑曲霉的凍干菌種管各一支 ,分別在無(wú)菌操作下打開(kāi) ,以毛細(xì)吸管加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯 ,輕柔吹吸數(shù)次 ,使菌種融化分散后 ,吸出滴入改良馬丁瓊脂斜面上 ,使均勻分布 ,置 2328培養(yǎng) 57 天。用接種環(huán)取適量第 1 代培養(yǎng)菌苔 ,劃線接種于改良馬丁瓊脂斜面上 ,同上述條件培養(yǎng)得第 2 代培養(yǎng)物。取第 2 代培養(yǎng)物 ,同法操作 ,得第 3 代培養(yǎng)物。用 5.0ml 吸管吸取無(wú)菌氯化

5、鈉溶液加入上述第三代新鮮斜面試管內(nèi) ,反復(fù)吹吸 ,洗脫孢子 ,用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布的毛細(xì)吸管吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi) ,用 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至不高于標(biāo)準(zhǔn)比濁管的濃度,即得每1ml 含菌數(shù)小于 100cfu 驗(yàn)證孢子懸液。3.2 薄膜過(guò)濾供試品試驗(yàn)組取規(guī)定量供試品 ,按無(wú)菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則薄膜過(guò)濾后 ,如為不含防腐劑供試品 ,則往其中一只濾筒內(nèi)接入 100ml 改良馬丁培養(yǎng)基 ,往另一只濾筒內(nèi)各接入 100ml 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 ,用 5ml 滅菌注射器抽取 1ml 驗(yàn)證菌液 ,從集菌培養(yǎng)器膠管處注入培養(yǎng)基中 ;如為含防腐劑供試品 ,則待供試品過(guò)濾完后 ,連續(xù) 3 次用0.1%蛋白胨水溶液沖洗濾膜 ,每張濾膜每次沖洗量為100ml,在最后一次沖洗液中 ,加入 1ml 驗(yàn)證菌液。每種制品抽取三批按上法操作。陽(yáng)性對(duì)照組取一套與供試品試驗(yàn)組相同的集菌培養(yǎng)器,不過(guò)濾供試品 ,直接向與供試品試驗(yàn)組相等量的培養(yǎng)基內(nèi)接入1ml 的驗(yàn)證菌液。陰性對(duì)照取規(guī)定量供試品 ,按無(wú)菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則薄膜過(guò)濾后,往其中一只濾筒內(nèi)接入 100ml 改良馬丁培養(yǎng)基 ,另一只濾筒內(nèi)接入100ml 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基。培養(yǎng)將硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置于3035培養(yǎng) ,改良馬丁培養(yǎng)基置于2025 ,分別在培養(yǎng)的第 1、2、3、4、5 天觀察并記錄結(jié)果?？山邮?/p>