氨基酸的薄層層析試驗(yàn)報(bào)告

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：XXX學(xué)號：XXXXXX專業(yè)年級：臨床八年制組別：第二實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)名稱(TitleofExperimetn)氨基酸的薄層層析實(shí)驗(yàn)日期(DateofExperiment)XX實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（LabNo.）第二實(shí)驗(yàn)室合作者(Partner)XXX指導(dǎo)老師(Instructor)XXXX總分(TotalScore)教師簽名(Signature)批改日期（Date）、實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)1.0實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆毡訉游龇ǖ囊话阍怼Ｕ莆瞻被岜訉游龇ǖ幕静僮骷夹g(shù)。掌握如何根據(jù)移動速率（R值）來鑒定被分離的物質(zhì)（即氨基酸混合液）。1.1 實(shí)驗(yàn)原埋1.1.1 薄層層析原理：（是色譜分析技術(shù)的一種）一般是將

2、固體吸附劑涂布在平板上形成薄層作為固定相。當(dāng)液相（展開溶劑）在固定相上流動時，由于吸附劑對不同氨基酸的吸附力不一樣，不同氨基酸在展開溶劑中的溶解度不一樣，點(diǎn)在薄板上的混合氨基酸樣品隨著展開劑的移動速率也不同，因而可以彼此分開。（即通過吸附-解吸-再吸附-再解吸的反復(fù)進(jìn)行，而將樣品各組分分離開來）1.1.2 .氨基酸與苗二酮的顯色反應(yīng)苗二酮水化后生成的水臺苗二酮在加熱時被還原，此產(chǎn)物匕氨基酸加熱分解產(chǎn)生的氨結(jié)合，以及另一分子水合苗二酮縮臺生成的紫化化合物叩使氨基酸斑點(diǎn)顯色。1.1.3 基于相對遷移率Rf值判定混合氨基酸組分層析中，物質(zhì)沿溶劑運(yùn)動方向遷移的距離與溶液前沿的距離之比為Rf值即:原點(diǎn)到

3、層析斑點(diǎn)中心的距離Rf=原點(diǎn)到斑點(diǎn)對應(yīng)前沿的距離由于物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故移動速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。2.1 實(shí)驗(yàn)材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品0.01mol/L丙氨酸：稱取丙氨酸8.9mg溶于90%異丙醇溶液至10ml。0.01mol/L精氨酸：稱取精氨酸17.4mg溶于90%異丙醇溶液至10ml。0.01mol/L甘氨酸：稱取甘氨酸7.5mg溶于90%異丙醇溶液至10ml?；旌习被崛芤海簩?.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等體積制成混合溶液。（上述溶液已由老師提前制備完成）2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑吸附劑：硅膠G（C.P.）。粘合劑：0

4、.5%羥甲基纖維素鈉（CMCNa取羥甲基纖維素鈉5g溶于1000ml蒸儲水中，煮沸，靜置冷卻，棄沉淀，去上清備用。展開溶劑：按80:10:10（V/V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸儲水，臨用前配制。0.1%西三酮溶液：取西三酮（A.R.）0.1g溶于無水丙酮（A.R.）至100ml。展層-顯色劑：按照10:1比例（V/V）混合展開劑和0.1%西三酮溶液。2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器和器材層析板（6cm<15cm）;小燒杯；量筒（10mL）;小尺子；毛細(xì)玻璃管；層析缸；烤箱；天平；藥匙。2.2 實(shí)驗(yàn)步驟2.2.1 實(shí)驗(yàn)流程制版1點(diǎn)樣層析'_A顯色1處理與結(jié)果分析1.3.2實(shí)驗(yàn)操作步驟步驟

5、操作(1)制版調(diào)漿：利用普通天平，粗稱取3g硅膠，加入0.5%羥甲基纖維素鈉8ml,調(diào)成均勻的糊狀涂布：取潔凈的干燥玻璃板均勻涂層干燥：將玻璃板水平放置，室溫下放置0.5h,自然晾干活化：70oC烘干30分鐘。切斷電源，待玻璃板面溫度下降至耳、燙手時取出。(2)點(diǎn)樣標(biāo)記：用鉛筆距底邊2cm水平線上均勻確定4個點(diǎn)。每個樣品間相距1cm點(diǎn)樣：用毛細(xì)管分別吸取氨基酸溶液，輕輕接觸薄層表面點(diǎn)樣。加樣后原點(diǎn)擴(kuò)散直徑不超過2mm自然晾干后，必要時可再重復(fù)點(diǎn)一次。(3)層析將薄層板點(diǎn)樣端浸入展層-顯色劑，展層-顯色劑液向應(yīng)低于點(diǎn)樣線。蓋好層析缸蓋，上行展層。當(dāng)展層劑前沿離薄板頂端2cm時，停止展層，(該實(shí)驗(yàn)

6、中超過板長度的2即可)3取出薄板，用鉛筆描出溶劑前沿界線。(4)顯色放置在烤箱中用85c下烘干，即可顯出各層斑點(diǎn)。(5)數(shù)據(jù)處理利用小尺子，測量各氨基酸色斑中心至樣品原點(diǎn)中心距離和溶液前緣至樣品原點(diǎn)中心的距離。計(jì)算RF值，從而判斷混合液的成分組成。注意事項(xiàng)吸附劑：實(shí)際實(shí)驗(yàn)要求不高，學(xué)生不用考慮。點(diǎn)樣：點(diǎn)樣的次數(shù)依照樣品的溶液的濃度而定，樣品量太少，有的成分不易顯示；樣品量太多，易造成斑點(diǎn)過大，互相交叉或拖尾。故：點(diǎn)樣后的斑點(diǎn)直徑一般為0.2cm。避免污染：切勿用手直接接觸薄層板面，必要時戴上手套。二、實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)條件制版過程：材料：3g的硅膠和0.5%羥甲基纖維素鈉8ml（實(shí)驗(yàn)室提供試劑，利用

7、普通天平稱取硅膠、利用10mL量筒量取CMCNa并利用小燒杯混合攪拌均勻。實(shí)驗(yàn)時間：約20min實(shí)驗(yàn)技巧：將糊狀物倒至潔凈玻璃板正中間，形成連續(xù)的一條線，并馬上開始左右來回晃蕩，使糊狀混合物向著玻璃板的兩邊蔓延。在邊緣的地方利用晃蕩和藥匙涂均勻后，再晃蕩幾次，使得全部糊狀物在玻璃板上均勻的形成涂層。實(shí)驗(yàn)失誤：在實(shí)驗(yàn)中，第一次由于糊狀物攪拌時間過久，變濃厚而不易使涂層變均勻，故導(dǎo)致制作的結(jié)果較差。后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程：材料：上一次同學(xué)制作的層析板（根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)可知該板的質(zhì)量不高）、4瓶已經(jīng)配制好的溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、前3種的任一比例混合物）、已經(jīng)含有展層-顯色劑的層析缸及烤箱等。實(shí)驗(yàn)時間：1h

8、左右實(shí)驗(yàn)技巧：在點(diǎn)樣過程中，必須垂直點(diǎn)樣，使樣液能充分被吸收。各實(shí)驗(yàn)過程按照要求即可，注意劃線以處理后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)失誤：無實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象制版過程：在自然晾干后，可見圖一所示的層析板。后續(xù)過程：在點(diǎn)樣后，溶液干燥后不能再明顯分析斑點(diǎn)的外圍。在層析約30min后溶劑前沿到達(dá)層析板的2/3處左右，可以取出并烘干。溶劑前沿并不是一條直線，故可認(rèn)為該層析板制作質(zhì)量不太高。在利用烤箱烘干后，層析板上出現(xiàn)5個藍(lán)紫色斑點(diǎn)，相互分析。結(jié)果可見圖二。圖一層析板圖二實(shí)驗(yàn)后的結(jié)果實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)即為各氨基酸色斑中心至樣品原點(diǎn)中心距離和溶液前緣至樣品原點(diǎn)中心的距離記錄，如下表：表一原始數(shù)據(jù)記錄表各斑點(diǎn)樣品原點(diǎn)中心品萌前緣

9、至原點(diǎn)中心距離丙氨酸3.60cm6.50cm精氨酸2.10cm6.40cm甘氨酸3.05cm6.40cm混合點(diǎn)12.01cm6.40cm混合點(diǎn)23.50cm6.40cm說明：由于溶劑前沿并不是一條直線，故我們選取了各斑點(diǎn)垂直的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率，減少實(shí)驗(yàn)誤差6.50cm6.40cm3.60cm3.05cm3.50cm2.10cm2.01cm三、結(jié)果與討論3.1結(jié)果處理利用原始數(shù)據(jù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理中的計(jì)算方式計(jì)算Rf值：c原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離一f原點(diǎn)到斑點(diǎn)對應(yīng)前沿的距離可得表一如下.各斑點(diǎn)Rf值氨基酸名稱丙氨酸0.554精氨酸0.328甘氨酸0.476混合點(diǎn)10.314精氨酸混合點(diǎn)2

10、0.547丙氨酸根據(jù)Rf值，我們可以測定并粗略地得到結(jié)果：在一定的系統(tǒng)誤差和實(shí)驗(yàn)誤差的允詫條件"混合的氨基酸溶液中，存在有精氨酸和丙氨酸兩種氨基酸。3.2討論結(jié)果上的誤差原因在實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中，我們可以發(fā)現(xiàn)混合點(diǎn)1（精氨酸）Rf=0.314#0.328=測定的標(biāo)準(zhǔn)值混合點(diǎn)2（丙氨酸）Rf=0.55400.547=測定的標(biāo)準(zhǔn)值。原因可能有：在整個實(shí)驗(yàn)過程中，層析板的制作是基礎(chǔ)，硅膠分布的均勻與否直接影響了實(shí)際的實(shí)驗(yàn)。而從溶劑前沿的彎曲可以知道，實(shí)驗(yàn)所用的層析板質(zhì)量不是很好，一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)測定，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的誤差。人為誤差的存在，在判定斑點(diǎn)前沿和測量距離時，存在一定的誤差，導(dǎo)致了結(jié)果

11、上的不一致性，但這類影響較小操作過程中存在一定的誤差，如層析時間不足等都有可能導(dǎo)致。3.2.2對實(shí)踐的指導(dǎo)與應(yīng)用價值學(xué)習(xí)制作層析板的技巧，多做多練，在練好基礎(chǔ)技能的前提下，可以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率和成功率。提高并嚴(yán)格按照各項(xiàng)操作的標(biāo)準(zhǔn)做實(shí)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行討論和分析結(jié)論薄層層析法操作簡單，在實(shí)驗(yàn)的結(jié)果上也比較的精確，能有效地分離出樣品各組分,運(yùn)用在本實(shí)驗(yàn)，效果也較好。最終可以得到結(jié)果：混合的氨基酸溶液中，存在有精氨酸和丙氨酸兩種氨基酸。思考題硅膠的吸附力與含水量的問題答：硅膠屬于極性吸附劑，根據(jù)活性級別越大，吸附能力越小的關(guān)系活性級別硅膠含水量（為吸附力I0dR5不m15斷增25強(qiáng)IVV38即硅膠的吸附能力與含水量呈負(fù)相關(guān)，含水量高，活度級數(shù)高，吸附力弱，反之亦然。吸附實(shí)驗(yàn)中吸附劑的選擇根據(jù)答：吸附劑的選擇一般需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)來確定。所選的吸附劑應(yīng)有以下幾個特點(diǎn)：最大的表面積和足夠的吸附能力對待不同的分離組分應(yīng)有不同的吸附能力與溶劑和樣品成分不會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)顆粒均分，不會碎裂。般的選擇標(biāo)準(zhǔn)可有: