代謝組學(xué)小常識(shí)

1、代謝組學(xué)小常識(shí)概念：代謝組：指一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中所有代謝物的集合，包含一系列不同類(lèi)型的小分子（通常分子量1000）,比如肽、碳水化合物、脂類(lèi)、核酸等。代謝組學(xué)：通過(guò)考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來(lái)研究生物體系的一門(mén)科學(xué)。實(shí)驗(yàn)流程：（以液質(zhì)聯(lián)用為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)為例）樣本前處理：在保證小分子代謝物完整的前提下，處理的步驟越簡(jiǎn)單越好，以保證操作容易重復(fù)，也為大批量樣本的處理節(jié)約時(shí)間。數(shù)據(jù)采集：依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠兴煌?。o非目標(biāo)代謝組學(xué)：選用高分辨質(zhì)譜儀（TOFOrbitrap等），有助于檢測(cè)到盡可能多的化合物，另外高分辨的質(zhì)核比數(shù)據(jù)也有助于數(shù)據(jù)庫(kù)

2、檢索以及化合物的鑒定。o目標(biāo)代謝組學(xué)：通常使用三重四極其桿質(zhì)譜，提高檢測(cè)的靈敏度以及定量的準(zhǔn)確性。數(shù)據(jù)預(yù)處理：峰提取，排列，歸一化。o多數(shù)質(zhì)譜商家都提供了配套的預(yù)處理軟件，例如安捷倫公司的MassHunter,熱電的Sieve,沃特世的MarkerLynx以及ProgenisisQI。o同時(shí)也有一些基于網(wǎng)絡(luò)的可以免費(fèi)獲取的軟件。建議使用配套的軟件，因?yàn)椴恍枰~外的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，不需要上傳數(shù)據(jù)，節(jié)省時(shí)間。數(shù)據(jù)分析：多元統(tǒng)計(jì)分析包括主成份分析（PCA,偏最小二乘判別分析（PLS-DA）,正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA，聚類(lèi)分析（HCA等。各個(gè)廠商也提供了相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析軟件，比如安捷倫的MPP熱

3、電的Sieve，沃特世的Ezinfor。目前常用的第三方軟件是Simca-p,同時(shí)也有一些網(wǎng)絡(luò)的開(kāi)源軟件可以使用?；衔镨b定：數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，二級(jí)質(zhì)譜對(duì)比。代謝組學(xué)文章中常見(jiàn)的統(tǒng)計(jì)圖（一）主成分分析（PCAPCA得分圖（scoreplot），用來(lái)看樣本天然的分組情況，在分析時(shí)不加任何分組信息。圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，樣本在空間中所處的位置由其中所含有的代謝物的差異決定。PCA載荷圖（loadingplot）,用來(lái)尋找差異變量。同種的每一個(gè)點(diǎn)代表樣本中還有的一個(gè)代謝物物，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的代謝物被認(rèn)為對(duì)樣本的分類(lèi)貢獻(xiàn)越大。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）得分圖和載荷圖的解釋同PCA區(qū)別在

4、于，PLS-DA在分析時(shí)提前賦予每個(gè)樣本分組信息，簡(jiǎn)單說(shuō)，就是在分析時(shí)擴(kuò)大組間差異，減少組內(nèi)差異，多用來(lái)尋找標(biāo)記物。正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA在OPLS-DA分析中，尋找標(biāo)記物通常使用S-plot。如圖中所示，得分圖中，兩組樣本分布在y軸兩側(cè)，通過(guò)S-plot可以獲得標(biāo)記物在兩組中相對(duì)含量的變化。也就是說(shuō)，處在S-plot右上角的化合物（距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對(duì)分類(lèi)貢獻(xiàn)越大）在處在得分圖y軸右側(cè)的樣本中含量較高，反之亦然。代謝組學(xué)文章中常見(jiàn)的統(tǒng)計(jì)圖（二）圖中每一行代表一個(gè)化合物，每一列代表一個(gè)樣本。上邊對(duì)樣本進(jìn)行聚類(lèi)分析，左邊對(duì)化合物進(jìn)行聚類(lèi)分析。綠色代表該化合物在樣本中含量較低，紅色代表

5、含量較高（也有用其他顏色表示的）。通過(guò)此圖，可以直觀地看出化合物在樣本間的變化趨勢(shì)；同時(shí)也可以找出具有相同變化趨勢(shì)的代謝物。在對(duì)化合物進(jìn)行鑒定之后或選擇出生物標(biāo)記物之后，可將化合物名稱(chēng)（或?qū)?yīng)的HMD或者KEG碗號(hào)）輸入MetaboAnalyst軟件（免費(fèi)）進(jìn)行此分析，來(lái)觀察體內(nèi)哪些代謝途徑受到了影響。在圖中，p值越小（-logo（p）越大）,pathwayimpact越大，證明該條代謝通路被嚴(yán)重?cái)_動(dòng)。此分析可用來(lái)尋找化合物之間的內(nèi)在聯(lián)系（數(shù)值上的聯(lián)系），如圖中紅色表示負(fù)相關(guān)，黃色表示正相關(guān)?？捎脕?lái)篩選與某一類(lèi)或者某一個(gè)自己感興趣的化合物產(chǎn)生正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)的代謝物。用來(lái)評(píng)價(jià)算選出的標(biāo)記物的診

6、斷能力。AUC®線下面積越大，診斷能力越好。非目標(biāo)代謝組學(xué)（untargetedmetabolomics）中常用的方法學(xué)考察的方法QC樣本的制備：混合相同體積的所有待檢測(cè)樣本，然后按照與待測(cè)樣本相同的前處理方法來(lái)處理QC羊本，之后進(jìn)樣進(jìn)行LC-M齡析。樣本檢測(cè)時(shí)，通常在檢測(cè)最開(kāi)始運(yùn)行幾次QC羊本，之后根據(jù)樣本量的大小在每檢測(cè)幾個(gè)樣本之后檢測(cè)一次QC羊本。方法學(xué)考察：方法一：最早使用的一種方法，從QC樣本的總離子流圖中選擇具有代表性的離子峰（覆蓋不同的保留時(shí)間，不同的強(qiáng)度），在對(duì)QC羊本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)之后，計(jì)算這些離子的保留時(shí)間以及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD,用以考察分析方法的穩(wěn)定性以

7、及重復(fù)性。方法二：所有樣品檢測(cè)完之后，收集所有的QC羊本的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括（峰提取，排列，歸一化等），經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾（80%規(guī)則）之后，計(jì)算剩下的峰的峰面積的RSD直。通常如果在一個(gè)樣本中有超過(guò)70%勺化合物的RSD值小于等于30%則證明該方法有良好的穩(wěn)定性以及重復(fù)性，所得到的數(shù)據(jù)可靠（也有不同的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，比如要求LC-MS數(shù)據(jù)小于20%GC-M傲據(jù)小于30臨）。圖中柱形圖表示化合物在不同RS刷圍內(nèi)的百分比分布，折線圖表示在不同RSW圍的累計(jì)百分比。方法三：原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理之后，將所有樣本（包括QC樣本）進(jìn)行PCA分析，在得分圖中觀察QC樣本的聚集程度。由于QC羊本是等量混合了

8、所有的被檢測(cè)樣本，理論上QC羊本包含了所有樣本中的代謝物，因此QC樣本理論上會(huì)分布在原點(diǎn)周?chē)?。圖中QC樣本緊密聚集，證明方法穩(wěn)定，重復(fù)性良好。方法四：采用混合標(biāo)準(zhǔn)品作為QC該QC通常包含不同物理化學(xué)性質(zhì)的體內(nèi)和體外代謝物（使所選擇的化合物具有代表性）。檢測(cè)結(jié)束后，計(jì)算這些化合物的保留時(shí)間以及峰面積的RSCffi以對(duì)分離分析方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。代謝組學(xué)研究中需要了解的質(zhì)譜知識(shí)（一）主要介紹以液質(zhì)聯(lián)用為分析工具的代謝組學(xué)研究中的常見(jiàn)問(wèn)題：1）在分析樣本時(shí)，要選用什么質(zhì)譜？2）質(zhì)譜儀中通常按照質(zhì)量分析器以及聯(lián)用方式的不同對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行分類(lèi)，常見(jiàn)的包括包括：?jiǎn)嗡募?jí)桿，三重四級(jí)桿，飛行時(shí)間（TOF,Q-TOF,離

9、子阱，線性離子阱（LTQ,靜電場(chǎng)軌道阱（Orbitrap）,LTQ-Orbitrap等。這么多質(zhì)譜，我們應(yīng)該如何選擇？在靶向代謝組學(xué)中，通常使用三重四級(jí)桿質(zhì)譜。因?yàn)榘邢虼x組學(xué)是針對(duì)某一些特定的化合物進(jìn)行定量檢測(cè)，而LC-QqQ/MS在MRMfi描模式下對(duì)化合物進(jìn)行定量分析（如藥代動(dòng)力學(xué)研究）已非常普遍，所以使用此方法以達(dá)到更高的靈敏度，更準(zhǔn)確的定量。在非靶向代謝組學(xué)研究中，需要選擇高分辨質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，因?yàn)楦叻直尜|(zhì)譜可以幫助我們檢測(cè)到盡可能多的化合物，提供所檢測(cè)化合物的精確分子量，同位素分布等信息，有助于化合物的鑒定。何為高分辨？首先了解以下分辨率，分辨率就是指質(zhì)譜儀區(qū)分兩個(gè)質(zhì)量相近的離子

10、的能力。這個(gè)區(qū)分能力也有不同的定義，如10%條谷分離，50%條谷分離等。理論知識(shí)就不多解釋了，舉個(gè)例子說(shuō)明便知。以H為例，低分辨質(zhì)譜測(cè)得的H的分子量為1,而高分辨質(zhì)譜測(cè)得的H分子量為（當(dāng)然，能測(cè)到多精確，取決于分辨率有多高）。有什么用呢？有用！以C2H4,CON2為例，這三者在低分辨質(zhì)譜中測(cè)得的分子量均為28,也就是說(shuō)低分辨的質(zhì)譜沒(méi)有辦法根據(jù)分子量將三者分離；但是高分辨質(zhì)譜測(cè)得三者的分子量分別為，可以將三者分開(kāi)。所以在非靶向代謝組學(xué)中，由于生物樣本中化合物的組成非常復(fù)雜，所以要用高分辨的質(zhì)譜儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到盡可能多的檢測(cè)到化合物的目的。常用的高分辨質(zhì)質(zhì)量分析器：TOF和Or比trap,以

11、及他們與其他質(zhì)量分析器的聯(lián)用形式如Q-TOFQ-Orbitrap,LTQ-Orbitrap等。注：可以簡(jiǎn)單的認(rèn)為，分辨率越高，區(qū)分離子的能力越強(qiáng)，即能夠區(qū)分離子在很細(xì)微的分子量上的差異。但請(qǐng)不要將分辨率和質(zhì)量精度混淆，兩者不一樣。有一個(gè)簡(jiǎn)單的類(lèi)比，低分辨質(zhì)譜對(duì)比高分辨質(zhì)譜就類(lèi)似于普通夭平對(duì)比十萬(wàn)分之一天平，精密天平可以區(qū)分物質(zhì)質(zhì)量的細(xì)微差異，但是夭平稱(chēng)出的質(zhì)量準(zhǔn)確與否，取決于夭平在使用之前是否校正。代謝組學(xué)研究中需要了解的質(zhì)譜知識(shí)（二）上一篇介紹了以下質(zhì)譜的分辨率，高分辨率質(zhì)譜有區(qū)分分子量細(xì)微差異的能力，但是測(cè)得的分子量準(zhǔn)確與否，則要看質(zhì)譜的質(zhì)量精度了。分辨率和質(zhì)量精度不一樣，高分辨質(zhì)譜也會(huì)有

12、質(zhì)量偏差很大的情況，那今天就來(lái)談一談質(zhì)量精度。什么是質(zhì)量精度？質(zhì)量精度指的是質(zhì)譜測(cè)得值和理論值之間的誤差。常以mD或者ppm表示。舉個(gè)例子：C6H12O6S論精確分子量為，如果測(cè)得分子量為，則誤差為或者即在液質(zhì)聯(lián)用中，化合物通常是以加合離子的形式出現(xiàn)，如M+H+,M+Na+等，以上只是舉例說(shuō)明。那么，如何保持較高的質(zhì)量精度呢？所有的高分辨質(zhì)譜在使用之前都需要對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行校正，這個(gè)校正其實(shí)就是校正質(zhì)譜的質(zhì)量軸。就像我們使用十萬(wàn)分之一天平時(shí)用一個(gè)200克的缺碼對(duì)夭平進(jìn)行校正一樣，質(zhì)譜的校正也是使用一系列已知分子量的物質(zhì)（覆蓋了從低到高的質(zhì)量范圍）對(duì)其進(jìn)行校正。可以接受的偏差通常為2ppm校正的頻率依實(shí)際情況而定，Q-TOF質(zhì)譜大多數(shù)一周校正一次，Orbitrap質(zhì)譜校正的頻率稍少一些。各大儀器廠商常用的校正液如下：在質(zhì)譜運(yùn)行過(guò)程中還需要同位素分布等信息，儀器的方便化合物的鑒定，推此外，幾乎所有的Q-TOF質(zhì)譜除了在檢測(cè)之前進(jìn)行質(zhì)量軸校正外,對(duì)質(zhì)譜進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。在非目標(biāo)代謝組學(xué)中，代謝物的鑒定通常依賴(lài)精確分子量，數(shù)據(jù)處理軟件通?？梢愿鶕?jù)采集到的質(zhì)譜圖對(duì)其元素組成進(jìn)行推測(cè),測(cè)的前提就是質(zhì)量精度要高，在進(jìn)行推測(cè)時(shí)通常需要輸入一個(gè)可以接受的誤差范圍（如土5