PCR產(chǎn)物的膠回收分離純化

1、PCR產(chǎn)物的膠回收分離純化一、實(shí)驗(yàn)儀器1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、紫外觀察分析儀3、離心機(jī)4、單面刀片5、恒溫水浴鍋二、試劑1、DNA回收試劑盒2、50XTAE3、 ddH2O三、步驟1 在紫外燈下切分含DNA的瓊脂糖塊，盡可能除去多余的瓊脂糖放入離心管中。4. 稱量膠塊重量，計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí)，以1mg=1林l進(jìn)行計(jì)算。5. 向膠塊中加入膠塊融化液DR-IBuffer，DR-IBuffer的加量如下表：凝膠濃度DR-IBuffer使用量3個(gè)凝膠體積量%-%4 個(gè)凝膠體積量%5個(gè)凝膠體積量6. 均勻混合后75加熱融化膠塊（低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠只需在45c加熱）。此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充

2、分融化（約610分鐘）。注）膠塊一定要充分融化，否則將會(huì)嚴(yán)重影響DNA的回收率。7. 向上述膠塊融化液中加入DR-IBuffer量的1/2體積量的DR-IIBuffer,均勻混合。當(dāng)分離小于400bp的DNA片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。8. 將試劑盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。9. 將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至SpinColumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄濾液。注）如將濾液再加入SpinColumn中離心一次，可以提高DNA的回收率。10. 將500”的漂洗液RinseA力口入SpinColumn中，12,000rpm離心30秒鐘，

3、棄濾液。11. 將700屋的Rinse劭口入SpinColumn中，12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。注）請(qǐng)確認(rèn)RinseB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇。12. 重復(fù)操作步驟11。13. 將SpinColumn安置于新的ml的離心管上，在SpinColumn膜的中央處加入25履的滅菌蒸儲(chǔ)水或HutionBuffer,室溫靜置1分鐘。注）把滅菌蒸餾水或ElutionBuffer加熱至60使用時(shí)有利于提高洗脫效率。14. 12,000rpm離心1分鐘洗脫DNA。將離心管（DNA）貯存于-20Co15瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收產(chǎn)物目的DMA膠塊DR-( Buffer )DR-ll I融解皎塊

4、溶液移至Spin Column加E山tion BufferDNA溶液Spin Column移至 1 5 ml Tuba70%RinseA清洗$訓(xùn)gluEnRinseB*制備：溶膠液：6MNaClO4(pH,0.03MNaAC(pH澳酚紅少許洗液：50mMTris-cl,0.1mMEDTA,pH乙醇存儲(chǔ)液：TEbuffer(10mMTris-cl，0.1mMEDTA，pH.注意事項(xiàng)1. 電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺(tái)子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源dna污染。2. 2.切膠是要把整個(gè)目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對(duì)比較薄的膠來(lái)做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來(lái)跑膠。3. 3.關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對(duì)于膠有特殊要求，例如要求不含EB,可以采用點(diǎn)marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來(lái)確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。4.4.按照正常程序點(diǎn)marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與