農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織的轉(zhuǎn)化精品資料

1、農(nóng)5愈傷組，織t?；锛夹g(shù)雜志2014年弟二期1材料和方法1.1材料1.1.1實(shí)驗(yàn)材料脹果甘草(GycyrrhizainfkataBatal.愈傷組織由為作者實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)并繼代保存；含有綠色熒光蛋白(GFP)基因的植物表達(dá)載體pBI121一gfp質(zhì)粒由河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院曲占良老帥饋贈(zèng)根癌農(nóng)桿菌EHA105i和LBA440】!困株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)丁靜娟教授饋贈(zèng)。1.1.2試劑DM2000marker,日本Takara公司;oligjodT15pimer(10pmol/L)美國(guó)Promeg.a公司；dNPs(各2.5rimo/L)日本Takara公司;6Lo*dingBufferTakara公司贈(zèng)

2、；瓊脂糖,北京索萊寶科技有限公司。1.1.3儀器設(shè)備BINA2C20D）凝膠成像分析儀北京賓達(dá)-Mr央創(chuàng)科技有限公司；HYA包溫?fù)u床中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；DYY一m6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠；DHP-2C00型電熱包溫培養(yǎng)箱天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SANYOMD一192型臥式超低溫冰箱日本三洋公司；DXZ25-JF穿P即C誨瀉實(shí)誨WpiT5&尊RT穿PS詳0禎WB5&尊+iWC穿PGT以CBprY禎WB5&以穿BKfliaWB5&尊W乙乙L。P沖LWM也c優(yōu)LUO,ePC時(shí)/6lu901+幸SIAI實(shí)WCWaCa92BWYWB5&尊日鑿湘&q回pFkCM湫魄表第adwWaWB5

3、&尊L乙L乙L0面C肉LIf叫K0門/6g靴觀s02HZoi,國(guó)泗-/6g*擊門6g0t1/60l。8|W：OL0Ciioe靴觀CKBSIAIC殍諂SIAIcMMW洲CMMWWiSIAI：直B幸直SI/13以kBPLL0旦眼田a直c淑叵flOZS板上仍然臺(tái)匕北夠繼續(xù)生長(zhǎng)并且結(jié)構(gòu)疏松顏色淡黃的愈傷組織為抗性愈傷組織統(tǒng)計(jì)并計(jì)算結(jié)果轉(zhuǎn)化率=抗性愈傷組織塊數(shù)/總塊數(shù)X100%篩選培養(yǎng)基為MS繼代培養(yǎng)基+Kan100)mg/l+Cb500mg/l篩選中愈傷組織每?jī)芍軗Q一次新鮮培養(yǎng)基共培養(yǎng)成后及篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)化愈傷組織時(shí)分別挑取少里愈傷組織在O_YMPUS舊X5熒光顯微鏡下用丁47()nm波長(zhǎng)藍(lán)光觀察綠色熒光

4、以檢測(cè)綠色熒光蛋白在植物細(xì)胞中的表達(dá)情況1.2.3根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化取含有植物表達(dá)載體pBI121一gfp質(zhì)粒的DH5菌株丁LB培養(yǎng)基中37C、200r/min過夜培養(yǎng)取過夜培養(yǎng)的菌液丁新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600：=0.6時(shí)收集菌體提取質(zhì)粒。利用改良的熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA10(j和LBA4404兩種菌株的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后在YE汨+柵1際g/i+Rif125mg/I抗性半板上篩選重組菌/曰到含有pBI121一gfp質(zhì)粒的兩種重組農(nóng)桿菌可直接活化用丁植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化或用終濃度為20%血甘油保存在一80C冰箱中備用1.2.4根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘草愈傷組織轉(zhuǎn)化挑取含有植物表達(dá)載體pBI121一gfp質(zhì)粒的E

5、HA10!5和LBA440菌株的單菌落接種丁YE1B+KCan100mg/i+Rif12!5m(J/I培養(yǎng)基中28c、180r/min過夜培養(yǎng)活化菌體。取1m菌液至5ml新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)40C0r/miin離心5min收集菌體用MS鹽溶液(pH7.0)重阜后侵染甘草愈傷組織。分別取繼代培養(yǎng)3d、7d、10d、15d的愈傷組織置丁重阜菌液中侵染15m】in;取繼代培養(yǎng)7d的材料設(shè)10min、15min、20rnin等不同侵染時(shí)問；侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸十表面多余菌液后接種丁鋪有無菌濾紙的MS基本培養(yǎng)基上25C里八、暗條件下共培養(yǎng)3d。1.2.5滬CR分析質(zhì)粒DN的少里

6、制備采用堿裂解法；轉(zhuǎn)化愈傷組織基因組DN*提取采用C-AB法。擴(kuò)增gfp基因使用的引物為:正向引物:5，一CCGCCGA(GGCATG5AGTAAV3反向引物:5，一GCCATCGCXAATTGGAiGTA3T。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為500bp的片段。擴(kuò)增反應(yīng)程序:熱啟動(dòng)94C3min94C變性30s50F退火30s72C延伸50s共30個(gè)循環(huán)。最后72C延伸3miin終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。2結(jié)果與分析2.1抗生素敏感性試驗(yàn)為了篩選出轉(zhuǎn)化后的抗性愈傷組織首先要對(duì)未轉(zhuǎn)化的甘草愈傷組織進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)以確合適的抗生素篩選濃度。選顏色淡黃、結(jié)構(gòu)疏松、分散性好的愈傷組織分散成

7、體積大約為0.5(cm2的小塊接種在分別含有0、25、50、100、125mg/l等不同濃度Kan的繼代培養(yǎng)基上每個(gè)濃度做3個(gè)半行。分別在繼代培養(yǎng)0d、15d、45d測(cè)愈傷組織鮮重并計(jì)算其相對(duì)生長(zhǎng)里。結(jié)果見表1愈傷組織的生長(zhǎng)速度隨看抗生素濃度的升高而越來越緩慢且相對(duì)生長(zhǎng)里降低。如果繼續(xù)培養(yǎng)愈傷組織會(huì)逐漸失水皺縮褐化死亡在Kan濃度為125mg/l時(shí)相對(duì)生長(zhǎng)里達(dá)到最低?？紤]到篩選抗生素濃度為Kan125mg/l時(shí)可臺(tái)匕北會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化后的抗性愈傷組織的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制并且Kan100卜9/1已經(jīng)對(duì)未轉(zhuǎn)化甘草愈傷組織的生長(zhǎng)具有較理想的抑制效果因此選擇Kan100rmg/l作為轉(zhuǎn)化后的抗性愈傷組織的抗生素篩選

8、濃度2.2根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因?qū)敫什萦鷤M織2.2.1轉(zhuǎn)化體系建立及轉(zhuǎn)化愈傷組織的綠色熒光蛋白(GI中）熒光檢測(cè)選擇EHA105和LBA440,4兩種根癌農(nóng)桿菌菌株熱激法轉(zhuǎn)入含有綠色熒光蛋白GFfp基因的植物表達(dá)載體pBI121一gfp挑選轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌用丁侵染脹果甘草愈傷組織設(shè)置不同繼代培養(yǎng)時(shí)問的愈傷組織和農(nóng)桿菌不同侵染時(shí)問兩組條件經(jīng)共培養(yǎng)3d后的甘草愈傷組織置丁熒光顯微鏡下觀察47()nm藍(lán)光激發(fā)愈傷組織細(xì)胞中明顯可見綠色熒光產(chǎn)生而在未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織以及用不含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織細(xì)胞中均未見綠色熒光產(chǎn)生圖1為共培養(yǎng)3d時(shí)的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)過篩選培養(yǎng)基中篩選45d獲

9、/曰了具有卡那霉素抗性的愈傷組織對(duì)抗性愈傷組織進(jìn)行熒光檢測(cè)同樣可見綠色熒光產(chǎn)生(圖略)說明抗性愈傷組織中表達(dá)了綠色熒光蛋白基因WB5&尊點(diǎn)日+1*鑿表+1W穿PGVC第uei1/6山00LCPSad詳cUlll9L#WB5&以P9LPOLPZPS實(shí)pr2B諼山6；0LVFBfli山6-tQW寸日1田項(xiàng)韁Ml聞BW健耳毛L以韁禎#BWB5&尊點(diǎn)日MH回以09S彭1用莘目項(xiàng)CW5&尊禎中BHW點(diǎn)日DS舞H山6韌CP9PBWWB5&以Mbi中-1伽00L田c穿PSB詳WB以點(diǎn)日鑿湘SBc1莘鑿表姚0諺鑿表山6以JOdK掃。1莘早C中BH8DS導(dǎo)舞H山6中WB5&尊W以1鑿表Od0鑿表KWB5&尊W業(yè)

10、否ZHCW用J乎中WB5&以禎乎MC-U山6dq()09ffi1用J中WB助禎以業(yè)MJffl靴IIBC山6J4Od田普CWB5&尊點(diǎn)日WWWTWi以如PGB第KOdH青山6WWWJL5&旦乙乙乙化率如表2表明LBA繼代培養(yǎng)7d的愈傷組織gfp菌株的轉(zhuǎn)化率在3d、EH105一gfpEHA105-gfp的為7d時(shí)最高達(dá)到96%)02.3.2不同侵染時(shí)問的影組織LBA4401-gfp菌株和組織10rnin、15nin、20nin篩選45d后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA440，4和EH愈傷組織做為陰性對(duì)昭八、侵染愈傷組織材料在15rnin20血時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)株都是在侵染時(shí)問為15且侵染時(shí)問為15!nin時(shí)的

11、時(shí)問為10!nin時(shí)的轉(zhuǎn)化率最佳侵染時(shí)問2.3.3不同菌株的影響通的受體愈傷組織和農(nóng)桿驗(yàn)條件轉(zhuǎn)化甘草愈傷440，4一gfp和EHA10!j-gfp均對(duì)轉(zhuǎn)化效率最高LBA440，4-7d、10d、15d時(shí)均低丁轉(zhuǎn)化率在繼代培養(yǎng)時(shí)問響取繼代培養(yǎng)7d的愈傷EHA105j-gfp分別侵染愈傷共培養(yǎng)3d后100|mg/lKan同時(shí)以不含pBI121一gfpA1055菌株分別侵染培養(yǎng)7d。LBA440，1一gfp和EHA105i一gfp侵染時(shí)問為101min果見表2、3兩種菌min時(shí)轉(zhuǎn)化率最高并轉(zhuǎn)化率高丁101min侵染高丁201nin因此15min是過使用不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)問菌不同侵染時(shí)問兩種實(shí)組織后轉(zhuǎn)化愈傷

12、組織的抗性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果如一gfp菌株的轉(zhuǎn)化率高丁EHA105一gfp侵染后的愈傷盛很難除去影響愈入篩選培養(yǎng)基之刖用洗二遍可以除去多余表明對(duì)丁根癌農(nóng)桿菌織遺傳轉(zhuǎn)化選擇繼代受體材料用EH105i-gfp用含有100mg/lKan的繼代培以獲/曰寸具有Kan抗性的轉(zhuǎn)效率可達(dá)97.114%。3討論目刖對(duì)甘草的研究主用成分方面對(duì)甘草愈工程調(diào)控研究和利用尚甘草愈傷組織有效成分含里較野生型高所以大里愈傷組織并對(duì)其有效緩解甘草資源日益表2、表3表明EHA105LBA440，4-gfp菌株。但是組織農(nóng)桿菌生長(zhǎng)旺傷組織生長(zhǎng)所以在轉(zhuǎn)附加50()mg/lCb的無菌水清的EHA10(j-gfp。以上結(jié)果介導(dǎo)的脹果甘草愈

13、傷組培養(yǎng)7d的愈傷組織作為侵染15imin共培養(yǎng)3d后養(yǎng)基進(jìn)行篩選45d后可化愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化要集中在植株的有效藥傷組織次生代謝的基因少。程煥欣等研究表明(如黃酮類化合物)的通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲次曰加以開發(fā)利用將成為枯竭等問題的有效途徑。通過基因工程的手段唐克軒課題組顯者提高了顛茄毛狀根芨著烷類生物堿的合成效率和產(chǎn)物的積累；通過采用一系列的轉(zhuǎn)基因調(diào)控方法美國(guó)加利福尼業(yè)大學(xué)伯克利分校的JayD.Ke?asling等利用酵母合成了產(chǎn)里超過100mg/l的青蒿素刖體物質(zhì)青蒿酸為進(jìn)一步降低抗瘧藥物的成本提供了希望?；蚬こ淌侄我讶找娉蔀檎{(diào)控次生代謝的有效途徑。范洪瓊通過誘導(dǎo)何首烏愈傷組織/曰到高大黃素大黃酸的細(xì)胞系;馬貴香等通過對(duì)黃苓愈傷組織培養(yǎng)過程中添加不同的外源激素探索了外源激素對(duì)黃苓愈傷組織中黃苓含里的影響。雖然愈傷組織在研究植物次生代謝途徑方面也扮演看重要角色但是運(yùn)用基因