甘肅省武威市高中生物第2章微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用2.2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)課件新人教版選修1

1、一、研究思路一、研究思路 1、PCR技術(shù)及提示技術(shù)及提示2、實(shí)驗(yàn)室微生物的篩選原理（、實(shí)驗(yàn)室微生物的篩選原理（P21）3、選擇培養(yǎng)基（閱讀配方）、選擇培養(yǎng)基（閱讀配方）（一一） 篩篩 選選 菌菌 株株 人為提供有利于目的菌株的條件（包括營養(yǎng)、溫度、人為提供有利于目的菌株的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pHpH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。 在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱做做選擇培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基。能分解尿素的細(xì)菌的篩選能

2、分解尿素的細(xì)菌的篩選 閱讀教材閱讀教材2222頁第一大段相關(guān)內(nèi)容，并思考回答下列問題：頁第一大段相關(guān)內(nèi)容，并思考回答下列問題： 1. 1.在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是是什么物質(zhì)？碳源和氮源的分別是是什么物質(zhì)？ 碳源是葡萄糖，氮源是尿素。碳源是葡萄糖，氮源是尿素。 2. 2.分析該配方的培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有篩分析該配方的培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有篩選作用？如果有，又是如何進(jìn)行篩選的？選作用？如果有，又是如何進(jìn)行篩選的？ 有篩選作用。有篩選作用。尿素是培養(yǎng)基中的尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源唯一氮源，因此，因此，原則上只有原則上只有能夠利用尿素

3、能夠利用尿素的微生物才能夠生長。的微生物才能夠生長。答：不一定，答：不一定，有些微生物可以利用其他微生物有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基的代謝產(chǎn)物生長繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物不一定是所需要的微生物，還上生長的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。 3.只要能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物是否就是只要能夠在選擇培養(yǎng)基上生長的微生物是否就是所需要的微生物？所需要的微生物？ 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋

4、液中面生長的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ囊粋€(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)地統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將確，通常將幾個(gè)稀釋度幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在3030300300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。（二二） 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目 1. 1.想一想，如何從平板上的菌落想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)，

5、最好能統(tǒng)計(jì)3 3個(gè)平板，計(jì)個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。 實(shí)例分析實(shí)例分析 第一同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)第一同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。 第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了三個(gè)平板，但是其中涂布了三個(gè)平板，但是其中1個(gè)平板的個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與計(jì)數(shù)結(jié)果與2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡(jiǎn)過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡(jiǎn)單地將單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均

6、值。個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。 實(shí)例啟示實(shí)例啟示 1、在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，一定要涂布至少、在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平個(gè)平板作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力和板作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力和準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性 2、在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)、在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。微生物數(shù)量測(cè)定方法微生物數(shù)量測(cè)定方法1、稀釋涂布平板法、稀釋涂布平板法間接技術(shù)方間接技術(shù)方法法（注：菌落數(shù)往往比活菌數(shù)（注：菌落數(shù)往往比活菌數(shù) ） 2、顯微鏡計(jì)數(shù)、顯微鏡計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)直

7、接計(jì)數(shù) （三）設(shè)置對(duì)照（資料分析）（三）設(shè)置對(duì)照（資料分析）1、設(shè)置對(duì)照的目的、設(shè)置對(duì)照的目的2、對(duì)照實(shí)驗(yàn)概念、對(duì)照實(shí)驗(yàn)概念A(yù) A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。的解釋有兩種。一是由于土樣不同一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。究竟是哪個(gè)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。究竟是哪個(gè)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。另一種方案另一種方案：將將A A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。實(shí)驗(yàn)方案有兩種實(shí)驗(yàn)

8、方案有兩種一種方案一種方案：可以由其他同學(xué)用與可以由其他同學(xué)用與A A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與驗(yàn)，如果結(jié)果與A A同學(xué)一致，則證明同學(xué)一致，則證明A A無誤；如果結(jié)無誤；如果結(jié)果不同，則證明果不同，則證明A A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。制有問題。通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)四、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下: :資料資料一一. .土壤取樣土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土從肥沃

9、、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3 cm3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。信封中。實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)名稱：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)（實(shí)驗(yàn)案例（實(shí)驗(yàn)案例 ） 在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為培養(yǎng)基可以作為對(duì)照對(duì)照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。起到了選擇作用。制備培養(yǎng)基：制備培養(yǎng)基：準(zhǔn)備準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和

10、和選擇培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基。 將將10 g10 g土樣加入盛有土樣加入盛有90 mL90 mL無菌生理鹽水無菌生理鹽水的錐形瓶中，充分搖勻，吸取上清液的錐形瓶中，充分搖勻，吸取上清液1 mL1 mL，轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)移至盛有移至盛有9 mL9 mL的生理鹽水的無菌大試管中，依的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至次等比稀釋至10107 7稀釋度，并按照由稀釋度，并按照由10107 710103 3稀稀釋度的順序分別吸取釋度的順序分別吸取0.1 mL0.1 mL進(jìn)行進(jìn)行平板涂布操作平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換不必更換移液管移液管。 資料資料 二二.

11、 .樣品的稀釋樣品的稀釋 由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為10103 310107 7。 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？嗎？ 答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量是不同答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：的，例如在干旱土壤中的上層樣本

12、中：好氧及兼性好氧及兼性厭氧細(xì)菌厭氧細(xì)菌數(shù)約為數(shù)約為2 1852 185萬，萬，放線菌數(shù)放線菌數(shù)約為約為477477萬，萬，霉菌數(shù)霉菌數(shù)約為約為23.123.1萬。因此，為獲得不同類型的微萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。 將涂布好的培養(yǎng)皿放在將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 30 溫度下培養(yǎng)。溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生。 比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落

13、的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。量、形態(tài)等，并做好記錄。 挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中圖圖2-102-10的顏色反應(yīng)。如果有則說明該的顏色反應(yīng)。如果有則說明該選擇培選擇培養(yǎng)基中養(yǎng)基中確實(shí)含有確實(shí)含有能分解尿素的細(xì)菌。能分解尿素的細(xì)菌。 資料三資料三. .微生物的培養(yǎng)與觀察微生物的培養(yǎng)與觀察 5. 5.細(xì)菌的計(jì)數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù) 當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在在3030300300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)稀釋度下，至少對(duì)

14、3 3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。目。 五、操作提示五、操作提示 無菌操作無菌操作 做好標(biāo)記做好標(biāo)記 規(guī)劃時(shí)間規(guī)劃時(shí)間 六、課題成果與評(píng)價(jià)六、課題成果與評(píng)價(jià) （一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以（一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。落生長，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于

15、選擇培養(yǎng)基的數(shù)目培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。出一些菌落。如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)如果學(xué)生選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要進(jìn)一步分析產(chǎn)生差異的原因。分析產(chǎn)生差異的原因。（二）樣品的稀釋操作是否成功（二）樣品的稀釋操作是否成功 如果得到了如果得到了2 2個(gè)或個(gè)或2 2個(gè)以上菌落數(shù)目在個(gè)以上菌落數(shù)目在3030300300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。 （三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致（三）重復(fù)組的結(jié)果是否一致

16、2提示：反芻動(dòng)物的瘤胃中含有大量的微生物，其提示：反芻動(dòng)物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣后會(huì)死亡，因此多為厭氧菌，接觸空氣后會(huì)死亡，因此分離其中能分離其中能分解尿素的微生物除了需要準(zhǔn)備選擇培養(yǎng)基外，還分解尿素的微生物除了需要準(zhǔn)備選擇培養(yǎng)基外，還應(yīng)參照厭氧菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。應(yīng)參照厭氧菌的培養(yǎng)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。 課后練習(xí)課后練習(xí)P26伊紅伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測(cè)自來水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因用來檢測(cè)自來水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，因?yàn)榈臑榈拇x產(chǎn)物與伊紅代謝產(chǎn)物與伊紅美藍(lán)結(jié)合美藍(lán)結(jié)合，使菌落呈，使菌落呈深紫色并帶有金屬光澤深紫色并帶有金屬光澤，使大腸桿菌的菌落，使大腸桿菌的菌落顯示出來，并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長和抑顯示出來，并沒有促進(jìn)大腸桿菌的生長和抑制其他微生物的生長。制其他微生物的生長。例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基例如：鑒別大腸桿菌培養(yǎng)基大腸桿菌呈大腸桿菌呈 黑色中心黑色中心 , ,有或無金屬光澤有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 本課題知識(shí)小結(jié)本課題知識(shí)小結(jié): :1.尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培養(yǎng)基時(shí)尿素是尿素分解