第章基因分析的基本策略

1、 從上世紀(jì)從上世紀(jì)70年代以來(lái)，與年代以來(lái)，與DNA、RNA操作相關(guān)的操作相關(guān)的各種分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，到目前已經(jīng)形成了一各種分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，到目前已經(jīng)形成了一個(gè)龐大而復(fù)雜的技術(shù)體系?；虿僮饕殉蔀獒t(yī)學(xué)研究個(gè)龐大而復(fù)雜的技術(shù)體系?；虿僮饕殉蔀獒t(yī)學(xué)研究的重要手段。簡(jiǎn)單地說(shuō)，基因操作就是所有涉及到的重要手段。簡(jiǎn)單地說(shuō)，基因操作就是所有涉及到DNA、RNA操作的技術(shù)。操作的技術(shù)。 本章主要討論如何對(duì)本章主要討論如何對(duì)基因進(jìn)行定性、定量分析基因進(jìn)行定性、定量分析；在；在隨后的隨后的2章里分別介紹基因功能研究的技術(shù)和基因工程章里分別介紹基因功能研究的技術(shù)和基因工程的有關(guān)內(nèi)容。的有關(guān)內(nèi)容。第

2、十一章第十一章 基因分析的基本策略基因分析的基本策略1、需要進(jìn)行基因的需要進(jìn)行基因的DNA序列分析序列分析:序列測(cè)定序列測(cè)定2、基因的染色體上定位：原位雜交技術(shù)、基因的染色體上定位：原位雜交技術(shù)3、研究基因在基因組中的拷貝數(shù)：、研究基因在基因組中的拷貝數(shù)：Southern Blot4、研究基因表達(dá)水平：、研究基因表達(dá)水平：Northern Blot、逆轉(zhuǎn)、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)錄實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù)5、研究基因表達(dá)產(chǎn)物的水平：、研究基因表達(dá)產(chǎn)物的水平：Western Blot、流式細(xì)胞儀（流式細(xì)胞儀（ FACS ）對(duì)一個(gè)已知或未知基因的內(nèi)容進(jìn)行研究步驟：對(duì)一個(gè)已知或未知基因的內(nèi)容進(jìn)行研究步驟：第一節(jié)第一節(jié)

3、利用利用DNA定性、定量分析可從不定性、定量分析可從不同角度對(duì)基因和基因組進(jìn)行研究同角度對(duì)基因和基因組進(jìn)行研究一、一、DNA序列測(cè)定可以揭示基因和基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)變化序列測(cè)定可以揭示基因和基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)變化DNA測(cè)序技術(shù)：測(cè)序技術(shù)： 1、雙脫氧鏈終止法、雙脫氧鏈終止法(Sanger法法) 2、化學(xué)裂解法、化學(xué)裂解法 3、PCR測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù) 4、全自動(dòng)、全自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)序儀 這些技術(shù)的發(fā)明這些技術(shù)的發(fā)明,都依賴(lài)于高分辨率的聚丙烯酰胺都依賴(lài)于高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù)1968年華裔生物化學(xué)年華裔生物化學(xué)、生物學(xué)家吳瑞博士（生物學(xué)家吳瑞博士（DrRay Wu） 獨(dú)創(chuàng)性地設(shè)計(jì)出

4、一種嶄新的獨(dú)創(chuàng)性地設(shè)計(jì)出一種嶄新的引物一延伸測(cè)序策略引物一延伸測(cè)序策略，并于并于1971年首次成功地測(cè)定了年首次成功地測(cè)定了噬菌體兩個(gè)噬菌體兩個(gè)COS末端的末端的完整序列；完整序列；1977，F(xiàn).Sanger在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了快速測(cè)在該策略的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了快速測(cè)定定DNA序列的末端中止法；序列的末端中止法；K.Mullis采納他的方法，完善了采納他的方法，完善了PCR擴(kuò)增擴(kuò)增DNA的方法；的方法；M.Smith發(fā)明了堿基定點(diǎn)突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全發(fā)明了堿基定點(diǎn)突變技術(shù)。這三位科學(xué)家全都獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。都獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。引物引物延伸測(cè)序策略延伸測(cè)序策略Sanger雙脫氧鏈終止法引入了

5、雙脫氧核苷三磷酸（雙脫氧鏈終止法引入了雙脫氧核苷三磷酸（2,3-ddNTP）作為鏈終止劑。）作為鏈終止劑。 2,3-ddNTP脫氧核糖的脫氧核糖的3位缺少羥基，它可以與多核苷位缺少羥基，它可以與多核苷酸鏈的酸鏈的3羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個(gè)核苷酸羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能與下一個(gè)核苷酸縮合，縮合，導(dǎo)致多核苷酸鏈的延伸終止導(dǎo)致多核苷酸鏈的延伸終止。如果在如果在DNA的合成反應(yīng)中，加入一種少量的的合成反應(yīng)中，加入一種少量的ddNTP，則，則多核苷酸鏈的延伸將在隨機(jī)的位點(diǎn)終止，生成一系列長(zhǎng)多核苷酸鏈的延伸將在隨機(jī)的位點(diǎn)終止，生成一系列長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。短不一的核苷酸鏈。在在4組獨(dú)立的組

6、獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的種不同的ddNTP，結(jié)果生成的，結(jié)果生成的4組核苷酸鏈將分別終止于各個(gè)組核苷酸鏈將分別終止于各個(gè)A，G，C，T的位置上。對(duì)這的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行高分辨變性聚組核苷酸鏈進(jìn)行高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。雙脫氧測(cè)序方法原理雙脫氧測(cè)序方法原理反應(yīng)：反應(yīng)：同時(shí)加入引物和模板、引物和模板、DNA聚合酶聚合酶I、一、一種種ddNTP、以及以及 四種四種dNTP（有一種帶放射性標(biāo)記）。變性膠電泳變性膠電泳分離反應(yīng)混合物。放射自顯影術(shù)放射自顯影術(shù)，檢測(cè)單鏈DNA片段的放射性。結(jié)果判讀結(jié)果判讀，

7、從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序。The DNA sequencing method developed by Sanger.n基本步驟：基本步驟：1、先將、先將DNA的末端之一標(biāo)記放射性同位素（的末端之一標(biāo)記放射性同位素（32P、35S）；）；2、再將、再將DNA樣品分別進(jìn)行多組具堿基特異性、隨機(jī)的、樣品分別進(jìn)行多組具堿基特異性、隨機(jī)的、不完全的化學(xué)修飾；不完全的化學(xué)修飾；3、采用修飾堿基敏感的特異化學(xué)試劑在修飾堿基位置斷、采用修飾堿基敏感的特異化學(xué)試劑在修飾堿基位置斷開(kāi)開(kāi)DNA鏈；鏈；4、通過(guò)具有可分辨鏈長(zhǎng)短僅一個(gè)核苷酸之差的聚丙烯胺、通過(guò)具有可分辨鏈長(zhǎng)短僅一個(gè)核苷酸之差的聚丙

8、烯胺凝膠電泳，將凝膠電泳，將DNA斷裂片段按分子大小分離開(kāi)；斷裂片段按分子大小分離開(kāi)；5、根據(jù)放射自顯影膠片上顯示的末端標(biāo)記片段分布情況，、根據(jù)放射自顯影膠片上顯示的末端標(biāo)記片段分布情況，直接讀出直接讀出DNA序列。序列?；瘜W(xué)裂解法（化學(xué)裂解法（Maxam-Gilbert） 1977反應(yīng)體系反應(yīng)體系 堿基修飾堿基修飾 堿基修飾堿基修飾 主鏈斷裂主鏈斷裂 斷裂點(diǎn)斷裂點(diǎn) 試劑試劑 反應(yīng)反應(yīng) 試劑試劑 G 硫酸二甲酯硫酸二甲酯 鳥(niǎo)嘌呤甲基化鳥(niǎo)嘌呤甲基化 六氫吡啶六氫吡啶 GG+A 甲酸甲酸 脫嘌呤作用脫嘌呤作用 六氫吡啶六氫吡啶 G/AC+T 肼肼 嘧啶開(kāi)環(huán)嘧啶開(kāi)環(huán) 六氫吡啶六氫吡啶 C/TC 肼（

9、加鹽）肼（加鹽） 胞嘧啶開(kāi)環(huán)胞嘧啶開(kāi)環(huán) 六氫吡啶六氫吡啶 C在化學(xué)修飾反應(yīng)中，通過(guò)控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有在化學(xué)修飾反應(yīng)中，通過(guò)控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，只有一小部分堿基被修飾，隨后進(jìn)行斷裂反應(yīng)也是定量。一小部分堿基被修飾，隨后進(jìn)行斷裂反應(yīng)也是定量。5-GATCACTACTG-35*-GATCACTACTG-35*G5* GATCACTACTG5*G5*GA5*GATCA5*GATCACTA5*GATCACTACTG5*GAT5*GATC5*GATCAC5*GATCACT5*GATCACTAC5*GATCACTACT5*GATC5*GATCAC5*GATCACTACGG+AC+TCG A/G

10、 C/T C5*G5*GA5*GAT5*GATC5*GATCAC5*GATCACTAC5*GATCA5*GATCACT5*GATCACTA5*GATCACTAC5*GATCACTACT5* GATCACTACTG硫酸二甲酯甲酸肼肼（加鹽）DNA自動(dòng)測(cè)序儀自動(dòng)測(cè)序儀 上述兩種方法都不適應(yīng)大規(guī)模上述兩種方法都不適應(yīng)大規(guī)模DNA測(cè)定需要。存測(cè)定需要。存在操作步驟繁瑣、效率低、速度慢的缺點(diǎn)，特別是讀在操作步驟繁瑣、效率低、速度慢的缺點(diǎn)，特別是讀結(jié)果的讀片過(guò)程。結(jié)果的讀片過(guò)程。 1987年發(fā)明了一種準(zhǔn)確快速的年發(fā)明了一種準(zhǔn)確快速的DNA測(cè)序方法，即測(cè)序方法，即激光測(cè)序法和配套的自動(dòng)測(cè)序儀。（用熒光染料結(jié)

11、合激光測(cè)序法和配套的自動(dòng)測(cè)序儀。（用熒光染料結(jié)合引物）。隨后又發(fā)明了終止標(biāo)記系統(tǒng)法。引物）。隨后又發(fā)明了終止標(biāo)記系統(tǒng)法。1、揭示基因和基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)變化在醫(yī)學(xué)研究中具、揭示基因和基因組一級(jí)結(jié)構(gòu)變化在醫(yī)學(xué)研究中具有重要意義。有重要意義。2、通過(guò)、通過(guò)DNA序列分析，可以鑒定基因和基因組變異。序列分析，可以鑒定基因和基因組變異。3、通過(guò)、通過(guò)DNA序列分析，可以鑒定分析人工重組的基序列分析，可以鑒定分析人工重組的基因。因。4、通過(guò)、通過(guò)DNA序列測(cè)定對(duì)定點(diǎn)突變進(jìn)行確認(rèn)。序列測(cè)定對(duì)定點(diǎn)突變進(jìn)行確認(rèn)。 DNA序列測(cè)定的意義序列測(cè)定的意義分析基因拷貝數(shù)變化分析基因拷貝數(shù)變化一、一、Southern bl

12、ot 檢測(cè)基因拷貝數(shù)變化檢測(cè)基因拷貝數(shù)變化 Southern blot 印跡雜交是指印跡雜交是指DNA與與DNA的雜交，的雜交，將電泳分離的待測(cè)將電泳分離的待測(cè)DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固定片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合到一定的固定支持物上，然后用標(biāo)記的支持物上，然后用標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)待測(cè)探針檢測(cè)待測(cè)DNA的一的一種方法。種方法。 1975年英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的年英國(guó)愛(ài)丁堡大學(xué)的Southern建立了該方法，建立了該方法， Southern印跡雜交由此得名。印跡雜交由此得名。Southern blot步驟步驟（1）待測(cè)核酸樣品的制備待測(cè)核酸樣品的制備：提取基因組DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶消化水解基因組D

13、NA，成大小不一的DNA片段。（2）待測(cè)待測(cè)DNA樣品的電泳分離。樣品的電泳分離。（3）凝膠中核酸的變性凝膠中核酸的變性：DNA在制備與電泳過(guò)程中DNA片段始終保持雙鏈結(jié)構(gòu)。電泳結(jié)束后DNA變性并轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)墓潭ㄖС治锷喜拍苓M(jìn)行Southern blot。變性通常用堿變性法。（4） Southern 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜：將凝膠中的DNA進(jìn)行堿變性并將pH恢復(fù)中性后，即可將凝膠中DNA轉(zhuǎn)移到固定支持物上。固定支持物固定支持物：硝酸纖維素（NC）膜、尼龍膜、化學(xué)活化膜和濾紙等。轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移方法：毛吸管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印跡法、真空轉(zhuǎn)移法。（5）已知序列的）已知序列的DNA探針的制備探針的制備（6） South

14、ern雜交雜交：在將固定于膜上的DNA片段與探針進(jìn)行雜交前，必須先進(jìn)行一個(gè)預(yù)雜交預(yù)雜交的過(guò)程。因?yàn)槟軌蚪Y(jié)合DNA的膜同樣可以和探針DNA結(jié)合，在進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)前，必須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)全部封閉。（7）雜交結(jié)果的檢測(cè)雜交結(jié)果的檢測(cè)：采用核素標(biāo)記的探針或發(fā)光劑標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交時(shí)，在雜交洗膜后，將濾膜和X線片裝入暗盒，感光后，經(jīng)沖洗，在X線片上可見(jiàn)黑色條帶。提取提取DNA限制性?xún)?nèi)切酶消化限制性?xún)?nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳堿變性堿變性轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NC膜膜與與DNA或或RNA探針探針雜交雜交放射自顯影放射自顯影DNA印跡雜交（印跡雜交（Southern blotting）檢測(cè)靶分子

15、為檢測(cè)靶分子為DNA, 檢測(cè)檢測(cè)靶分子是否含有目的基因靶分子是否含有目的基因1、對(duì)某種生物體基因組拷貝數(shù)研究，需要完整提 取出基因組，并需要適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶酶切；2、通常要研究的基因序列是已知的。3、探針序列的選擇和探針信號(hào)的選擇。Southern blot 檢測(cè)基因拷貝數(shù)注意事項(xiàng)檢測(cè)基因拷貝數(shù)注意事項(xiàng)二、二、采用采用PCR技術(shù)也可以分析基因拷貝數(shù)技術(shù)也可以分析基因拷貝數(shù)原理：原理： 細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程。參與復(fù)制的有多種因素。PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，PCR原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系相對(duì)簡(jiǎn)單。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系： 耐熱的Taq DNA聚合酶、化學(xué)合成

16、的寡聚核苷酸引物、4種dNTP、以及合適的緩沖液體系。PCR反應(yīng)的基本過(guò)程：變性、退火、延伸反應(yīng)的基本過(guò)程：變性、退火、延伸 PCR技術(shù)對(duì)擴(kuò)增的模板濃度雖然很低，擴(kuò)增產(chǎn)量技術(shù)對(duì)擴(kuò)增的模板濃度雖然很低，擴(kuò)增產(chǎn)量以一個(gè)恒定的指數(shù)率上升，但經(jīng)過(guò)以一個(gè)恒定的指數(shù)率上升，但經(jīng)過(guò)25至至30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)個(gè)循環(huán)，產(chǎn)量會(huì)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，同時(shí)量會(huì)達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，同時(shí)PCR過(guò)程中，還會(huì)出現(xiàn)過(guò)程中，還會(huì)出現(xiàn)“試管效應(yīng)試管效應(yīng)”，因些對(duì)不同樣本量的比較無(wú)法直接用，因些對(duì)不同樣本量的比較無(wú)法直接用PCR技術(shù)來(lái)鑒定。技術(shù)來(lái)鑒定。 近年來(lái)，隨著近年來(lái)，隨著PCR技術(shù)的不斷改進(jìn)，如差異顯示技術(shù)的不斷改進(jìn)，如差異顯示PCR和實(shí)時(shí)

17、和實(shí)時(shí)PCR的發(fā)明，可以用于基因拷貝數(shù)的分析。的發(fā)明，可以用于基因拷貝數(shù)的分析。根據(jù)根據(jù)Poly A序列起點(diǎn)前序列起點(diǎn)前2個(gè)堿基除個(gè)堿基除AA外只有外只有12種可能性種可能性的特征，設(shè)計(jì)合成了的特征，設(shè)計(jì)合成了12種下游引物，稱(chēng)種下游引物，稱(chēng)3-錨定引物錨定引物；同時(shí)為擴(kuò)增出同時(shí)為擴(kuò)增出polyA上游上游500bp以?xún)?nèi)所有可能性的以?xún)?nèi)所有可能性的mRNA序列，在序列，在5端又設(shè)計(jì)了端又設(shè)計(jì)了20種種10bp長(zhǎng)的隨機(jī)引物長(zhǎng)的隨機(jī)引物。這樣構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行這樣構(gòu)成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增能產(chǎn)生出擴(kuò)增能產(chǎn)生出20000條左右條左右的的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定條帶，其中每一條都代表一種特定m

18、RNA種，這種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類(lèi)型中所表一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細(xì)胞類(lèi)型中所表達(dá)的全部達(dá)的全部mRNA。 （1）差異顯示）差異顯示PCR用于基因拷貝數(shù)分析用于基因拷貝數(shù)分析 將差別表達(dá)條帶中的將差別表達(dá)條帶中的DNA回收，擴(kuò)增至所需含量，回收，擴(kuò)增至所需含量，進(jìn)行進(jìn)行Southern blot或或Northern blot或直接測(cè)序，從或直接測(cè)序，從而對(duì)差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達(dá)的而對(duì)差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達(dá)的目的基因。目的基因。差異顯示差異顯示PCR方法仍然存在幾個(gè)難以解決的問(wèn)題：方法仍然存在幾個(gè)難以解決的問(wèn)題： (1)重復(fù)率低，

19、至少有重復(fù)率低，至少有20%的差異條帶不能被準(zhǔn)確的差異條帶不能被準(zhǔn)確重復(fù)；重復(fù)；(2)假陽(yáng)性率可以高達(dá)假陽(yáng)性率可以高達(dá)90%；(3)獲得的差異獲得的差異表達(dá)序列極少包含編碼信息。表達(dá)序列極少包含編碼信息。（2）代表性差異分析技術(shù)）代表性差異分析技術(shù) 該技術(shù)是將差減雜交與該技術(shù)是將差減雜交與PCR有機(jī)結(jié)合形成的一種方法有機(jī)結(jié)合形成的一種方法.主要步驟主要步驟:1、將對(duì)照組、將對(duì)照組(driver)和待測(cè)組和待測(cè)組(tester)mRNA逆轉(zhuǎn)錄成逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段群片段群,接上接頭進(jìn)行第一次接上接頭進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增擴(kuò)增;2、將兩組、將兩組PCR產(chǎn)物片段群用產(chǎn)物片段群用限制性?xún)?nèi)切酶酶切限制性?xún)?nèi)

20、切酶酶切,形成平均形成平均長(zhǎng)度長(zhǎng)度256bp的長(zhǎng)度；的長(zhǎng)度；3、將接頭消化、將接頭消化, 在在tester組末端接上新的接頭組末端接上新的接頭,tester組和組和driver組按組按1:100比例混合，過(guò)量的比例混合，過(guò)量的driver可與可與tester中互補(bǔ)中互補(bǔ)的部分形成雙鏈；的部分形成雙鏈；4、復(fù)性、復(fù)性, 按新接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第按新接頭序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行第2輪輪PCR，只有，只有tester和和tester雜合體才能和引物配對(duì)雜合體才能和引物配對(duì), 大量擴(kuò)增；大量擴(kuò)增；實(shí)時(shí)PCR根據(jù)PCR反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)設(shè)計(jì)的分析方法。在PCR反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)體系中的模板的產(chǎn)物濃度較低，而引物

21、是過(guò)量的，產(chǎn)物和模板復(fù)性不會(huì)形成與引物競(jìng)爭(zhēng)，此時(shí)產(chǎn)物含量呈指數(shù)增加。 當(dāng)PCR產(chǎn)物積累后，產(chǎn)物的復(fù)性可以競(jìng)爭(zhēng)引物與模板的結(jié)合，產(chǎn)物增加減慢，最后進(jìn)入平臺(tái)期。所以對(duì)樣品中的cDNA進(jìn)行定量分析的最佳時(shí)期是反應(yīng)早期。（3）實(shí)時(shí)）實(shí)時(shí)PCR用于基因拷貝數(shù)分析用于基因拷貝數(shù)分析 實(shí)時(shí)PCR原理是：在PCR反應(yīng)體系中加入一種雙色熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，并根據(jù)探針上熒光信號(hào)的變化計(jì)算模板DNA含量。如：TaqMan系統(tǒng)。在寡核苷酸探針的5端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光染料端標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光染料，3端端標(biāo)記一個(gè)猝滅染料標(biāo)記一個(gè)猝滅染料。當(dāng)光源照射到探針時(shí)，被激活的報(bào)告熒光染料將能量轉(zhuǎn)移給附近的猝滅染料而不發(fā)光。當(dāng)PCR

22、產(chǎn)物擴(kuò)增時(shí)，聚合酶遇到結(jié)合在模板上的熒光探針時(shí)，利用聚合酶所具有的5-3外切酶作用，將兩種染料分離，因此根據(jù)報(bào)告熒光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度與被切探針成正比，由此可以計(jì)算出PCR產(chǎn)物的含量。實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)特別適合于低拷貝基因的定量。技術(shù)特別適合于低拷貝基因的定量。實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR需要包括熱循環(huán)儀、計(jì)算機(jī)、光學(xué)儀需要包括熱循環(huán)儀、計(jì)算機(jī)、光學(xué)儀器用于熒光激發(fā)和收集器、數(shù)據(jù)處理和分析軟器用于熒光激發(fā)和收集器、數(shù)據(jù)處理和分析軟件。件。ROMA分析基因拷貝數(shù)分析基因拷貝數(shù)nROMA（代表性寡核苷酸陣列分析）：是將RDA與芯片微距陣分析技術(shù)相結(jié)合。n利用人類(lèi)基因組序列預(yù)測(cè)并設(shè)計(jì)了能與代表性片段雜交的寡核苷酸探

23、針，制成芯片，然后與RDA篩選出來(lái)的代表性差異PCR產(chǎn)物在芯片上進(jìn)行雜交，用計(jì)算機(jī)分析雜交結(jié)果。核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細(xì)胞核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細(xì)胞或組織后，將標(biāo)記的或組織后，將標(biāo)記的核酸探針核酸探針與與細(xì)胞或組織中的核酸細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱(chēng)為進(jìn)行雜交，稱(chēng)為原位雜交原位雜交。原位雜交不需要從組織提取核酸，對(duì)組織中含量極低原位雜交不需要從組織提取核酸，對(duì)組織中含量極低的靶序列有的靶序列有很高的靈敏度很高的靈敏度，并可，并可完整保持組織與細(xì)胞完整保持組織與細(xì)胞形態(tài)形態(tài)，更能準(zhǔn)確反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀，更能準(zhǔn)確反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能

24、狀態(tài)。態(tài)。三、原位雜交技術(shù)可以分析基因在染色體上位置三、原位雜交技術(shù)可以分析基因在染色體上位置 根據(jù)檢測(cè)對(duì)象不同可將原位雜交分為細(xì)胞內(nèi)原位雜交細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片原位雜交組織切片原位雜交。同時(shí)原位雜交既可檢測(cè)DNA，也可檢測(cè)RNA，所用探針不同而已。核酸探針根據(jù)標(biāo)記方法的不同可粗略分為放射性探針?lè)派湫蕴结樅头欠派湫蕴结樂(lè)欠派湫蕴结槂深?lèi)。放射性同位素標(biāo)記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對(duì)人體有害，且受半衰期限制等缺點(diǎn)，非放射性探針可以用生物素、地高辛 、熒光素標(biāo)記探針。（一）固定固定：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。最常用的固定劑是多聚甲醛，其它

25、的固定劑（如戊二醛）。（二）玻片和組織切片的處理玻片和組織切片的處理：包括玻片處理、細(xì)胞組織切片的處理、降低背景、預(yù)雜交。（三）雜交雜交：調(diào)整探針的濃度（0.55.0ng/l） 、探針長(zhǎng)度（50100個(gè)堿基）、雜交的溫度和時(shí)間?；痉椒ɑ痉椒ǎㄋ模╇s交后處理雜交后處理：包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。（五）顯示顯示：根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類(lèi)分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。（六）結(jié)果分析真核生物的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA、dsRNA、微小RNA等。目前在上述RNA研究中，以mRNA研究最為熱點(diǎn)。它的研究可以提示基因的結(jié)構(gòu)、基

26、因的活性、或基因的變異等。mRNA研究常用的方法有Northern blot、原位雜交、實(shí)時(shí)PCR、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)、cDNA芯片技術(shù)和RT-PCR。第二節(jié)第二節(jié) 利用利用RNA定性定量分析可定性定量分析可 從不同角度揭示基因表達(dá)活性從不同角度揭示基因表達(dá)活性 Northern blot印跡雜交是指待測(cè)RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固定支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行固-液相雜交。原理同Southern blot。但因Northern blot印跡雜交法檢測(cè)的是RNA，在外界環(huán)境中極易被環(huán)境中的RNA酶所降解，因此制備RNA樣品時(shí)，所需器皿均需要特殊處理。同時(shí)作為監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)RNA含量不夠準(zhǔn)確，

27、只能作為定性分析定性分析RNA方法方法。（一）（一）Northern blot定性分析定性分析RNA RT-PCR是一種以mRNA為模板的體外擴(kuò)增cDNA的技術(shù)。其基本程序是：提取細(xì)胞總RNA，然后將其中的mRNA在體外逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行特定基因的PCR擴(kuò)增。因?yàn)镻CR擴(kuò)增產(chǎn)物有平臺(tái)效應(yīng)，故RT-PCR也也一般用于一般用于RNA的定性分析的定性分析。將陽(yáng)性參照基因作為內(nèi)參照與待測(cè)RNA在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，可以對(duì)RNA進(jìn)行相對(duì)定量分析相對(duì)定量分析。參照基因： -肌動(dòng)蛋白（-actin）、3-磷酸甘油醛脫氫酶、rRNA基因等。（二）（二）RT-PCR用于定性、定量分析

28、用于定性、定量分析RNA三、三、RNA酶保護(hù)試驗(yàn)酶保護(hù)試驗(yàn)了解基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接了解基因轉(zhuǎn)錄后的選擇性剪接RNA酶保護(hù)試驗(yàn)：可用于mRNA定量、 mRNA末端定位、 mRNA剪切部位確定內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置。RNA酶保護(hù)試驗(yàn)：全新的酶保護(hù)試驗(yàn)：全新的mRNA定量分析定量分析方法方法 其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA； 未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為R

29、NA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。RPA有有Northern Blot無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)：無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)： 1.探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應(yīng)更加完全。 2.RPA比Northern Blot靈敏15150倍。3.RPA通量高，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，可評(píng)價(jià)他們?cè)谕磺闆r下的差異表達(dá)。 4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研究速度 。監(jiān)測(cè)大量基因表達(dá)的最好方法之一是cDNA微陣列技術(shù)，利用這種技術(shù)可以同時(shí)測(cè)定成千上萬(wàn)個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄活性。基本原理：應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核酸序列雜交，通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性或定量分析基因的表達(dá)情況。特點(diǎn)：能在同一時(shí)間內(nèi)平行分析大量的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，