PCR技術(shù)及其延伸與應(yīng)用（課堂PPT）

1、1PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用 2 聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反(Polymerase Chain Reaction, PCR）又稱無細(xì)胞克隆技術(shù)(“free bacteria”cloning technique) 特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法。 在數(shù)小時(shí)內(nèi)可使幾個(gè)拷貝的模板序列甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增107108倍，大大提高了DNA的得率。3 PCR技術(shù)最早由美國Cetus公司人類遺傳研究室Kary Mullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的； 最早的應(yīng)用報(bào)道是Saiki等1985年將PCR技術(shù)應(yīng)用于-珠蛋白基因擴(kuò)增和鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷。 使用1976年Chien等分離的熱

2、穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大為簡化，并使PCR自動(dòng)化成為可能； 1987年Kary Mullis等完成了自動(dòng)化操作裝置，使PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)用階段。 4 PCR已獲得廣泛應(yīng)用,目前，每年都有上千篇文章發(fā)表。 1991年，期刊“PCR方法與應(yīng)用”（PCR Methods and Application）在美國創(chuàng)刊，使有關(guān)學(xué)者有了自己的論壇和參考的專業(yè)期刊。 Kary Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。(一名加拿大籍英國科學(xué)家Michael Smith因開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變”的方法而與Mullis同享此榮)5PCR技術(shù)檢測細(xì)菌 鴨疫里默氏桿菌

3、 霍亂弧菌 食源性病原細(xì)菌 結(jié)核桿菌6PCR與病毒類疾病應(yīng)用 雜交法檢測植物病毒和類病毒 利用RT-PCR對黃瓜病毒源種類進(jìn)行檢測 診斷人類乳頭狀病毒HPV感染7診斷遺傳疾病8PCR的特點(diǎn) 特異性高-聚合酶 首次報(bào)導(dǎo)用大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段。90會(huì)變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入；同時(shí)引物是在37延伸 Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的，擴(kuò)增過程中，單核苷酸的錯(cuò)誤參入程度很低、其錯(cuò)配率一般只有約萬分之一9 高度敏感： 理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上。 應(yīng)用證實(shí)可以將極微量的靶DN

4、A成百萬倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測分析量的DNA。 能從100萬個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個(gè)感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測。 10 快速 簡便 可擴(kuò)增RNA或cDNA 11試劑 引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物。 耐熱的DNA聚合酶： 10PCR緩沖液500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。 dNTP貯備液 DNA模板 12操作程序 試劑混合 PCR儀程序設(shè)計(jì)：94變性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循環(huán)3

5、0-35次。最后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72溫育5min，以確保充分延伸。 13PCR反應(yīng)基本條件及其對PCR的影響 模板核酸 有機(jī)溶劑酚 蛋白質(zhì)污染 核酸污染 核酸的量 14引 物 引物與PCR的特異性， 引物限定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。 合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。 凍干引物于-20至少保存12-24個(gè)月，液體狀態(tài)于-20可保存6個(gè)月。引物不用時(shí)應(yīng)存于-20保存。 15緩沖液 緩沖液的目的：給Taq DNA聚合酶提供一個(gè)最適酶催反應(yīng)條件。 目前最為常用的緩沖體系為10-50mmol/LTris-HCl (Tris是一種雙極性離子緩沖液，pH變化于6.8

6、-7.8之間。將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時(shí)會(huì)增加產(chǎn)量。 50mmol/L以內(nèi)的KCl，50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應(yīng)液中以NH+4代K+。 反應(yīng)中加入小牛血清白蛋白（100g/ml）或明膠（0.01%）或Tween 20（0.05% 0.1%） 5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）有助于酶的穩(wěn)定，尤其在擴(kuò)增長片段（此時(shí)延伸時(shí)間長）時(shí)。16Mg2+ Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實(shí)性。影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度引物二聚體的形成等。 Mg2+濃度過低時(shí)，酶活力顯著降低；過高時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的累

7、積。 Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+ 。 DNA模板，引物和dNTP 的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實(shí)際濃度。17三磷酸脫氧核苷酸dNTP dNTP是DNA合成的基本原料。 含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。 dNTP濃度過高會(huì)導(dǎo)致其錯(cuò)誤摻入（即所謂的“熱力背信”）。一般認(rèn)為最適的dNTP濃度為50200mol/L。 dNTP的質(zhì)量也直接影響PCR反應(yīng)的成敗。 18耐熱DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段使 PCR得到廣泛應(yīng)用。 Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定性DNA

8、聚合酶。 Taq DNA聚合酶簡化了PCR程序,增加了PCR特異性及PCR擴(kuò)增效率。該酶的最適溫度很高（79）， 100l反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳， Taq DNA聚合酶保存不當(dāng)而失活是PCR實(shí)驗(yàn)失敗的常見原因。19溫度循環(huán)參數(shù) 變性溫度與時(shí)間 復(fù)性溫度與時(shí)間 延伸溫度與時(shí)間 循環(huán)數(shù)： 20PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題對策 假陰性問題 假陽性問題。 21假陰性 Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制 引物設(shè)計(jì)不合理 提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及 PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng) 循環(huán)次數(shù)不夠22假陽性 微量的靶基因污染 標(biāo)本間的交叉污染 樣品中存在有靶基因的同源序列 PCR操作時(shí)要隔離

9、不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。 23PCR技術(shù)的延伸 PCR是一種技術(shù)和方法，在使用中不同的人根據(jù)自己的試驗(yàn)?zāi)康?、結(jié)合自己的知識背景、研究、創(chuàng)造了不同的PCR方法，開拓了PCR應(yīng)用的新領(lǐng)域。現(xiàn)在至少有15種不同的PCR用于不同的試驗(yàn)。24反轉(zhuǎn)錄PCR-Reverse transcription PCR一種檢測底豐度特異 的方法 互補(bǔ)靶cDNA生成 雙鏈靶DNA 擴(kuò)增靶DNA25RTPCR反應(yīng)體系 PCR的反應(yīng)體系但是模板是RNA RNA酶抑制劑RNasin 反轉(zhuǎn)錄酶 禽酶禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus,AMV) 鼠酶莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)26Touch down PCR 一般PCR的體系 一般PCR的設(shè)計(jì)原理 不同的PCR過程 目的：在不知道理想退火溫度的條件下保證擴(kuò)出產(chǎn)物27梯度PCR 在特殊PCR儀上進(jìn)行的一般PCR 目的：尋找最佳的退火溫度 與TouchDown PCR的區(qū)別 TD PCR：對同一PCR體系采用不同的退火 溫度進(jìn)行 PCR循環(huán) 梯度PCR：同時(shí)對多個(gè)PCR體系采用不同的退火溫度進(jìn)行PCR循環(huán)28巢（套）式PCR-nested Primer PCR 不同的PCR體系兩對引物 不同的PCR過程兩段循環(huán) 目的：