2022年農(nóng)殘分析12--農(nóng)藥殘留的酶抑制法與免疫測定

1、農(nóng)藥農(nóng)藥(nngyo)殘留的酶抑制法與免疫殘留的酶抑制法與免疫測定技術(shù)測定技術(shù)第一頁，共十六頁。6.1 酶抑制分析測定法酶抑制分析測定法 1951年年,Giang與與Hall應用有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)應用有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥在體外對膽堿酯酶具有抑制作用的機理來測定其含藥在體外對膽堿酯酶具有抑制作用的機理來測定其含量量. 1968年年Mendoza利用利用(lyng)薄層薄層-酶抑制技術(shù)測定酶抑制技術(shù)測定10種有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥種有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥,最小檢出量可達納克水平最小檢出量可達納克水平. 1975年年Kramer與與Gamson用一種與靛酚乙酸酯相似用一種與靛酚乙酸酯相似的化合物

2、的化合物,測定測定110g的各種有機磷酸酯化合物的各種有機磷酸酯化合物,與此同與此同時時,Zweig等也測定了甲萘威等農(nóng)藥等也測定了甲萘威等農(nóng)藥. 進入進入20世紀世紀80年代年代,人們開始以來源豐富人們開始以來源豐富,取材和制取材和制備都十分方便的備都十分方便的植物酶源植物酶源,建立薄層建立薄層-植物酯酶抑制方植物酯酶抑制方法法,為酶抑制法的進一步推廣和應用創(chuàng)造了條件為酶抑制法的進一步推廣和應用創(chuàng)造了條件.第二頁，共十六頁。6.1.2 酶法檢測原理酶法檢測原理 有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥 對參與神經(jīng)生理傳遞過程的乙對參與神經(jīng)生理傳遞過程的乙酰膽堿酯酶酰膽堿酯酶AChE具

3、有抑制作用具有抑制作用,使該酶的分解作用不能正使該酶的分解作用不能正常進行常進行,從而導致底物乙酰膽堿的積累從而導致底物乙酰膽堿的積累,影響動物正常的神影響動物正常的神經(jīng)傳導經(jīng)傳導,引起中毒引起中毒(zhng d)或死亡或死亡. 可將這一昆蟲毒理學原理應用到農(nóng)藥殘留檢測中可將這一昆蟲毒理學原理應用到農(nóng)藥殘留檢測中,如如果農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液中不含有或含有很低的有機磷或氨果農(nóng)產(chǎn)品樣品提取液中不含有或含有很低的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥基甲酸酯類農(nóng)藥,酶的活性就不被抑制酶的活性就不被抑制,試樣中加入的基質(zhì)試樣中加入的基質(zhì)就被酶水解就被酶水解,或少部分水解或少部分水解, 水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應產(chǎn)生水解

4、產(chǎn)物與加入的顯色劑反應產(chǎn)生顏色顏色;反之反之,如果試樣提取液中含有一定量的有機磷或氨基如果試樣提取液中含有一定量的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥甲酸酯類農(nóng)藥, 酶的活性就被抑制酶的活性就被抑制,試樣中加入的基質(zhì)就不試樣中加入的基質(zhì)就不被酶水解被酶水解, 從而不顯色或顏色很淺從而不顯色或顏色很淺,用分光光度計測定吸光用分光光度計測定吸光度值度值,計算出抑制率計算出抑制率,就可判斷出樣品中農(nóng)藥殘留情況就可判斷出樣品中農(nóng)藥殘留情況.第三頁，共十六頁。6.1.3 酶源選擇與提取酶源選擇與提取 酶源選擇是生物酶技術(shù)應用的基礎酶源選擇是生物酶技術(shù)應用的基礎,其其性質(zhì)的好壞性質(zhì)的好壞,特異性大小特異性大小,穩(wěn)定與

5、否直接關(guān)系穩(wěn)定與否直接關(guān)系到檢測的結(jié)果到檢測的結(jié)果. 在酶抑制檢測的技術(shù)中在酶抑制檢測的技術(shù)中,既有應用既有應用AChE的的,也有應用非特異性酯酶的也有應用非特異性酯酶的,其來源其來源既有動物的既有動物的,也有植物的也有植物的.6.1.4 底物和底物和 顯色劑顯色劑 酶抑制劑顯色反應酶抑制劑顯色反應(fnyng)可使用的底物和可使用的底物和顯色劑很多顯色劑很多,大致可分為以下幾類大致可分為以下幾類:第四頁，共十六頁。(1)乙酰膽堿乙酰膽堿-溴百里酚藍顯色溴百里酚藍顯色;(2) 乙酸乙酸-萘酯萘酯-固藍固藍B鹽顯色反應鹽顯色反應;(3)乙酸羥基吲哚顯色法乙酸羥基吲哚顯色法;(4)乙酸靛酯顯色法乙

6、酸靛酯顯色法;6.1.5 檢測方法檢測方法(1)比色法比色法: 我國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥我國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥(nngyo)檢定所利用檢定所利用酶抑制產(chǎn)生的顯色反應酶抑制產(chǎn)生的顯色反應,通過分光光度計比通過分光光度計比色測定酶的抑制率色測定酶的抑制率,以測定有機磷和氨基甲以測定有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量酸酯類農(nóng)藥殘留量.第五頁，共十六頁。(2)酶片法酶片法: 酶片即為浸漬有膽堿酯酶或其他敏感酶類的濾酶片即為浸漬有膽堿酯酶或其他敏感酶類的濾紙或類似載體物質(zhì)紙或類似載體物質(zhì).(3)固相酶速測技術(shù)固相酶速測技術(shù)6.2 免疫檢測技術(shù)免疫檢測技術(shù) 免疫分析概述免疫分析概述 當細菌、病毒和有害物等病原入侵時當細菌、病毒

7、和有害物等病原入侵時,能產(chǎn)生抵御外來能產(chǎn)生抵御外來物的抗體，這就是動物的免疫反應物的抗體，這就是動物的免疫反應(fnyng)，致病的外，致病的外來物稱為抗原。來物稱為抗原。 免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應為基礎的分析技術(shù)。為基礎的分析技術(shù)。第六頁，共十六頁。酶聯(lián)免疫吸附測定法酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA) 原理是在測定過程，樣品提取液中的農(nóng)藥與已知數(shù)原理是在測定過程，樣品提取液中的農(nóng)藥與已知數(shù)量的酶聯(lián)劑競爭有限數(shù)量的抗體量的酶聯(lián)劑競爭有限數(shù)量的抗體(kngt)吸附位點。吸附位點。 為了觀察測定結(jié)果，往往加入底物和顯色劑，以為了觀察

8、測定結(jié)果，往往加入底物和顯色劑，以產(chǎn)生顏色變化。根據(jù)樣品顏色和標準物質(zhì)顏色的吸光產(chǎn)生顏色變化。根據(jù)樣品顏色和標準物質(zhì)顏色的吸光度之差就可計算出樣品中農(nóng)藥的含量度之差就可計算出樣品中農(nóng)藥的含量. 農(nóng)藥殘留免疫分析方法的建立，一般包括待測農(nóng)藥的農(nóng)藥殘留免疫分析方法的建立，一般包括待測農(nóng)藥的選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前選擇、半抗原合成、人工抗原合成、抗體制備和樣品前處理方法等幾個步驟處理方法等幾個步驟.第七頁，共十六頁。(1)直接直接ELISA原理原理: 是在抗原與抗體發(fā)生反應后，直接進行顯色的非是在抗原與抗體發(fā)生反應后，直接進行顯色的非均相固相反應免疫分析方法。均相固相反應免疫

9、分析方法。 1類類:首先將抗原固定在聚苯乙烯反應板孔內(nèi)壁，然首先將抗原固定在聚苯乙烯反應板孔內(nèi)壁，然后加入后加入待測抗原待測抗原和和酶標記酶標記(bioj)抗體，固相抗原與待測游離抗體，固相抗原與待測游離抗原競爭抗原競爭有限量有限量的酶標記抗體，反應后洗去可溶性的的酶標記抗體，反應后洗去可溶性的游離抗原與抗體的結(jié)合物，加入酶作用底物，測定固游離抗原與抗體的結(jié)合物，加入酶作用底物，測定固相抗原與抗體結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測抗原相抗原與抗體結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測抗原的量。酶反應活性與待測抗原的量呈負相關(guān)的量。酶反應活性與待測抗原的量呈負相關(guān).第八頁，共十六頁。2類: 首先固定抗體，然

10、后同時加入待測抗原首先固定抗體，然后同時加入待測抗原(kngyun)和酶標和酶標記抗原記抗原(kngyun)，待測抗原，待測抗原(kngyun)與酶標記抗原與酶標記抗原(kngyun)競競爭爭有限量有限量的固相抗體，反應后測定固相抗體與酶標記的固相抗體，反應后測定固相抗體與酶標記抗原結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測抗原的量。抗原結(jié)合物上的酶活性，便可得到待測抗原的量。 酶活性強度與待測抗原呈負相關(guān)。酶活性強度與待測抗原呈負相關(guān)。(2) 間接間接ELISA原理原理 首先固定抗原，然后加入待測抗原和抗體，固相抗原首先固定抗原，然后加入待測抗原和抗體，固相抗原與待測抗原競爭有限的第一輪抗體，反應后洗去

11、游離的與待測抗原競爭有限的第一輪抗體，反應后洗去游離的結(jié)合物，再加入酶標記的第二抗體結(jié)合物，再加入酶標記的第二抗體(以第一抗體為抗原的以第一抗體為抗原的酶標記抗體酶標記抗體)，反應后吸取酶標記的游離抗體，測定結(jié)，反應后吸取酶標記的游離抗體，測定結(jié)合物上的酶活性。酶活性與待測抗原濃度呈負相關(guān)。合物上的酶活性。酶活性與待測抗原濃度呈負相關(guān)。第九頁，共十六頁。(3)半抗原的制備 抗原是指一切能刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞，抗原是指一切能刺激機體產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞，并能與之結(jié)合發(fā)生特異性免疫反應的物質(zhì)。并能與之結(jié)合發(fā)生特異性免疫反應的物質(zhì)。 抗原具有抗原具有免疫原性免疫原性和和反應原性反應原性。

12、 免疫原性免疫原性是指能刺激機體產(chǎn)生抗體或能誘導機體產(chǎn)是指能刺激機體產(chǎn)生抗體或能誘導機體產(chǎn)生免疫應答反應；生免疫應答反應； 而而反應原性反應原性是指能與其是指能與其(yq)誘導產(chǎn)生的抗體或致敏誘導產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞進行反應的特性。淋巴細胞進行反應的特性。 既具有免疫原性反又具有反應原性的抗原稱為既具有免疫原性反又具有反應原性的抗原稱為完全完全抗原抗原, 而只具有而只具有反應原性反應原性而沒有免疫原性的抗原稱為而沒有免疫原性的抗原稱為不完不完全抗原全抗原,也稱也稱半抗原半抗原.第十頁，共十六頁。(4)人工免疫抗原的合成人工免疫抗原的合成 首先將半抗原活化，然后通常是在條件溫和的水溶首先將半

13、抗原活化，然后通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價結(jié)合。液中將半抗原與載體蛋白共價結(jié)合。 如半抗原分子含有羧基，可用碳二亞胺法或混合如半抗原分子含有羧基，可用碳二亞胺法或混合酸酐法，如具有羥基活性基團則采用琥珀酸酐法酸酐法，如具有羥基活性基團則采用琥珀酸酐法.(5)農(nóng)藥農(nóng)藥(nngyo)抗體制備抗體制備 農(nóng)藥抗體是經(jīng)由小分子農(nóng)藥與大分子載體偶聯(lián)后的農(nóng)藥抗體是經(jīng)由小分子農(nóng)藥與大分子載體偶聯(lián)后的復合物復合物免疫動物使機體產(chǎn)生抗農(nóng)藥的抗體，并取其免免疫動物使機體產(chǎn)生抗農(nóng)藥的抗體，并取其免疫動物血清，然后進行分離、鑒定其特異性而得到的。疫動物血清，然后進行分離、鑒定其特異性而得到的。農(nóng)藥抗

14、體的產(chǎn)生一般可采用兩種途徑農(nóng)藥抗體的產(chǎn)生一般可采用兩種途徑.第十一頁，共十六頁。1)多克隆抗體技術(shù)多克隆抗體技術(shù) 多克隆抗體是由許多多克隆抗體是由許多B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的混合抗體淋巴細胞克隆產(chǎn)生的混合抗體.2)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單抗雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單抗 單克隆抗體是指由一個單克隆抗體是指由一個B淋巴細胞分化增殖的漿細胞產(chǎn)生淋巴細胞分化增殖的漿細胞產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇的抗體的針對單一抗原決定簇的抗體.(6)ELISA方法的選擇方法的選擇分為五種類型分為五種類型:1)酶標抗原直接競爭抑制法酶標抗原直接競爭抑制法;2)酶標抗體直接競爭抑制法酶標抗體直接競爭抑制法;3)酶標抗體間接酶標抗體間接(jin

15、ji)競爭抑制法競爭抑制法;4)抗體夾心法抗體夾心法; 5)間接夾心法間接夾心法第十二頁，共十六頁。(7)實驗條件的選擇實驗條件的選擇 必須注意以下幾個方面必須注意以下幾個方面: 1)確定酶結(jié)合的最適濃度確定酶結(jié)合的最適濃度. 2) 確定包被確定包被(bo bi)物質(zhì)的最適濃度物質(zhì)的最適濃度. 3)樣品往往會產(chǎn)生交叉反應樣品往往會產(chǎn)生交叉反應. 4)樣品前處理時樣品前處理時,使用的溶液必須考慮其影響抗體對分使用的溶液必須考慮其影響抗體對分析物識別的可能性析物識別的可能性.(8)ELISA法的特點法的特點: 1)適用現(xiàn)場快速篩選適用現(xiàn)場快速篩選; 2)適用常規(guī)方法難以檢測的農(nóng)藥適用常規(guī)方法難以檢

16、測的農(nóng)藥; 3)適用環(huán)境監(jiān)控適用環(huán)境監(jiān)控.第十三頁，共十六頁。6.3 生物傳感器在農(nóng)藥殘留檢測中的應用6.3.1 生物傳感器的原理生物傳感器的原理 生物傳感器是指由一種生物敏感部件與轉(zhuǎn)換器緊生物傳感器是指由一種生物敏感部件與轉(zhuǎn)換器緊密配合密配合,對特定種類物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和對特定種類物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應的分析裝置可逆響應的分析裝置. 傳感器的生物敏感層與復雜樣品中特定的目標分析傳感器的生物敏感層與復雜樣品中特定的目標分析物之間物之間,如酶與底物如酶與底物,抗原與抗體抗原與抗體,外源凝集素與糖外源凝集素與糖,核酸與核酸與其互補片段之間的識別反應其互補片段之間的識別反應(fnyng)會產(chǎn)生一些物理化學信會產(chǎn)生一些物理化學信號的變化號的變化,這些變化通過不同原理的傳感器轉(zhuǎn)換成這些變化通過不同原理的傳感器轉(zhuǎn)換成第二信第二信號號,經(jīng)放大后顯示記錄經(jīng)放大后顯示記錄.第十四頁，共十六頁。6.3.2 電化學生物傳感器測定農(nóng)藥殘留電化學生物傳感器測定農(nóng)藥殘留 生物傳感器中信號的測量主要有電化學和光化學兩種生物傳感器中信號的測量主要有電化學和光化學兩種.電化學生物傳感器可分為電位型和安培型兩種電化學生物傳感器可分為電位型和安培型兩種.免疫傳感器免疫傳感器 是利用抗體是