艾蒿黃酮的提取分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其抗氧化性研究_圖文

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文艾蒿黃酮的提取分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其抗氧化性研究姓名:吳娜申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):食品科學(xué)指導(dǎo)教師:孫智達(dá)20080601 華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屆頌l:學(xué)位論義倍。用硫代巴比妥酸(TBA法測定艾蒿黃酮對小鼠紅細(xì)胞溶血、小鼠肝組織勻漿及肝線粒體脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA生成的影響,結(jié)果表明艾蒿黃酮在O.510.0mg/mL濃度范圍內(nèi)可提高體外小鼠血清抗活性氧能力,能抑制小鼠紅細(xì)胞溶血,抑制小鼠肝組織勻漿及肝線粒體MDA的生成和肝線粒體腫脹,說明艾蒿黃酮具有體外對小鼠細(xì)胞器、細(xì)胞的抗氧化作用。艾蒿黃酮的體內(nèi)抗氧化實驗表明,艾蒿黃酮對降低小鼠肝臟MDA含量有顯著的作用;能提高小鼠血

2、清SOD活性;說明艾蒿黃酮具有一定的體內(nèi)抗氧化作用。關(guān)鍵詞艾蒿;黃酮;分離;鑒定;抗氧化 華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屆碩Ij學(xué)位論義硫酸鋰分析純磷酸分析純無水硫酸鈉分析純沈陽市試劑三廠中國藥品生物制品檢定所分析天平Sartorius Instruments Ltd.,Germany電子天平北京賽多利斯天平有限公司101.2型干燥箱上海市實驗儀器總廠紫外光柵分光光度計752型上海分析儀器總廠70pH Meter Beckman.GermanyHeidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器Made in GermanyXL.1型箱式高溫爐河南省鶴壁市熱工儀表廠電熱套上海予華儀器有限公司揮發(fā)油提取器上海嵐虹玻璃儀器有限公司1

3、.2實驗方法準(zhǔn)確稱耿每份樣品2.5009,采用105。C干燥恒重法測定(食品分析,2002。準(zhǔn)確稱取每份樣品2.5009,采用525干燥恒重法測定(食品分析,2002。準(zhǔn)確稱取每份樣品10.0009,采用酸堿滴定法測定(食品分析,2002。準(zhǔn)確稱取每份樣品5.0009,采用比色法測定(食品分析,2002。14艾薔趟酮的提耿分離純化、結(jié)構(gòu)雅定及jC抗釩化件研究精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品O.0209,用95%乙醇超聲溶解,并定容于100mL容量瓶中。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分別置于25mL比色管中,加30%乙醇至6mL,加入lmL5%的NaN02,搖勻

4、后靜置6min,再加入lmLlO%的AL(N033,搖勻后靜置6min,再加入10mL4%的NaOH,加水至25mL 搖勻后靜置15min,以第一支試管溶液為空白,用1cm比色皿,在510nm下分別測定不同濃度的蘆丁的吸光度。即得標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度Y和濃度X的關(guān)系式:Y=0.446X-0.0105,R=0.9999。采用FolinfenCiocalteau法測定干燥艾葉中總多酚的含量(Singleton V L et a1., 1965。配制Folinfen.Ciocalteau試劑和20%飽和碳酸鈉溶液。v:765nm處所測Abs;x:所測樣品溶液的總多酚濃度(rng/L。華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屆

5、壩Ij學(xué)位論文取0.2mL樣品溶液,加入12mL水、lmLFC試劑,靜置8min,加入3mL20%碳酸鈉溶液,加水定容至20mL,搖蕩,靜置2h,在765nm處比色。按照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法,測定其吸光值,并計算樣品中總酚含量?？偡雍?CxVxn/(Wx1000x100%C:總多酚濃度,mg/L;V:溶液體積,mL;n:稀釋倍數(shù);W:取樣量,mg。取509的艾蒿粉末,加入200mL水浸泡lOb,連接揮發(fā)油提取器,采用常規(guī)共水蒸餾法回流提取5h,收集揮發(fā)油,置冰箱中冷藏。最終提取揮發(fā)油的收油率約為0.57%。揮發(fā)油為黃褐色透明油狀物,具有濃郁香味。2結(jié)果與分析表2-1艾蒿中主要化學(xué)成分含量測定

6、結(jié)果Tablet2-1Analysis of main nutrition elements and flavonoid percent3結(jié)論湖北武漢獅子山所產(chǎn)艾蒿黃酮含量較高,有較高的研究價值,所以確定為實驗材料。 。仁中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屆碩l:學(xué)位論文818型Ph計OROINO Research,Inc752型紫外光柵分光光度計上海分析儀器總廠m70pH Meter Beckman,GermanyHeidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器Made in Germany恒溫水浴鍋浙江檢測儀表廠1.2試驗方法艾蒿黃酮(Flavonoids ofArtemisia argyi,簡稱FA含量的測定:采用硝酸鋁-亞

7、硝酸鈉.氫氧化鈉比色法分析(劉志勤等,2004。準(zhǔn)確稱取干燥艾蒿粉術(shù)樣品1.0009,料液比為1:15,在70C條件下提取一次,提取時間為180分鐘,乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%。過濾,濾液用相應(yīng)濃度的乙醇定容至100mL,吸取1.0mL,此溶液即為樣品溶液。準(zhǔn)確稱取干燥艾蒿粉末樣品1.0009,用60%的乙醇,料液比為1:15,在70條件下提取一次,提取時間分別為60、120、180、240、300分鐘。過濾,濾液用60%的乙醇定容至lOOmL,吸取1.0mL,此溶液即為樣品溶液。準(zhǔn)確稱取干燥艾蒿粉末樣品1.0009,用60%的乙醇,料液比為1:15,提取時間為180

8、分鐘。提取溫度分別為40、50、60、70、80。過濾,濾液用60%的乙醇定容至100mL,吸取1.0mL,此溶液即為樣品溶液。艾.苗黃酬的提取分離純化、結(jié)構(gòu)貉定發(fā)je抗鈑化件:|Jf究準(zhǔn)確稱取干燥艾蒿粉術(shù)樣品1.0009,用60%的乙醇,在80C條件下提取,每次提取時間為90分鐘。提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5次。過濾,濾液用60 %的乙醇定容至100mL,吸取1.0mL,此溶液即為樣品溶液。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,選出影響艾蒿黃酮提取率的3個主要因素(提取溫度、時間及乙醇濃度設(shè)計正交實驗,進行優(yōu)化組合,考察指標(biāo)為:艾蒿黃酮提取液的吸光值。表3-1正交試驗的因素和水平水平X1時f司(minX

9、2乙醇濃度(%X3溫度(稱取艾蒿干粉3009,以57%的乙醇,料液比為1:20,在73回流浸提3h,抽濾得艾蒿提取液,回收溶劑,濃縮之后的提取液黃酮含量為37.56mg/mL。將大孔樹脂于95%乙醇中浸泡8h,然后用蒸餾水洗至無乙醇;再用5%HCl 溶液浸泡3h,用蒸餾水洗至流出水pH值為中性;然后用5%NaOH溶液浸泡3h,用蒸餾水沈至流出水pH值為中性。每次上樣沈脫完畢后,先用2%HCl沈至無色及用蒸餾水洗至pH值為中性;再用2%NaOH洗至無色,最后用蒸餾水洗至pH值為中性。將濃度為37.56mg/mL的艾蒿提取濃縮液分別通過已預(yù)處理好的D一101、ADS.17、AB.8樹脂柱,柱體積為

10、22mL,柱長度12cm,柱內(nèi)直徑1.3cm(按樹脂體積算進行動態(tài)吸附。用I%FeCl3檢查流出液,待反應(yīng)呈陽性(檢測顯色時,表明有黃酮流出,樹脂吸附達(dá)到飽和,停止上樣,記錄上柱量。吸附1小時后,樹脂柱先用水沈至無色并用苯酚濃硫酸法檢測至無糖,再用95%乙醇沈脫至沈脫液 仁中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屆碩Ij學(xué)位論義,一ee:一。O、:呻:一0e0C一0:芷一5,圖3.8(B溫度、乙醇濃度對提取的影響等高線圖Fig.3-8(BContour map of the effects of extraction as a function of temperatureand ethanol concentra

11、tion在中心組合實驗的基礎(chǔ)上,經(jīng)曲面擬合,由回歸方程可以計算出提取的最佳工藝條件為:時間149.47min,乙醇濃度56.04%,溫度72.12。艾蒿黃酮提取率理論值可達(dá)89%。為了檢驗擬合結(jié)果的可靠性,采用上述最佳條件進行驗證實驗,將最佳提取條件修正為時間149min,乙醇濃度56%,溫度72,料液比l: 20,提取2次。重復(fù)3次取平均值,艾蒿黃酮提取率為91.2%,證明最佳提取條件的可靠性。2.3艾蒿黃酮的純化表3.53種大孔樹脂對艾蒿黃酮的吸附分離性能比較Table3-5Comparison of adsorbing and separating capability of six t

12、ypes of macroporous resin on Artemisia argyi flavonoids大孔樹脂的吸附性能對黃酮的純化影響很大,樹脂的極性和空間結(jié)構(gòu)(主要艾-篙竹酮的提取分離純化、結(jié)構(gòu)搭定及1e抗瓴化忡研究指孔徑、比表面積及孔容等是影響吸附性能的重要因素。在所選擇的3種大孔樹脂中,D.101非極性,AB.8為弱極性,ADS.17為極性(馮濤等,2002。由表3-5可知,AB.8型大孔樹脂分離純化艾蒿總黃酮效果較好,總黃酮吸附量最高,回收率、吸附率最大,因為黃酮具有多酚結(jié)構(gòu)和糖苷鍵,顯弱極性,因而有利于弱極性樹脂的吸附。Table3-6Effect of different

13、 loaded amount on the purification ofArtemisia argyi flavonoids by using AB一8type resin由表3.6可知,柱體積為22mL,4mL時上樣達(dá)到飽和;上柱量為3mL時,黃酮回收率最高;但是上柱量4mL時,洗脫液中黃酮含量最大,回收率只匕L3mL略低。考慮到純化效率,粗提液上樣體積以4mL為宜(鄭功源等,2003。圖3.9淋洗液pH值對艾蒿黃酮純化效果的影響F ig.39Influence of pH values of water on the purification of Artemisia argyiflav

14、onoids由圖39可知水的pH值對純化有影響,當(dāng)pH值5時總黃酮回收率最高,以pH 值5的水洗效果最好。 艾筒黃酬的提取分離純化、結(jié)構(gòu)黲定及JL抗氧化性研究動態(tài)沈脫效果見圖3-10。從沈脫曲線可以看出?4倍柱體積50%的乙醇就基本可將吸附在樹脂上總黃酮沈脫下來,并且曲線出峰快。沈脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收乙醇后,冷凍干燥,產(chǎn)品純度達(dá)到69%。因此,用5倍柱體積50%乙醇沈脫效果很好(Yujie Fu et a1.,2007。表3-9大孔樹脂使用次數(shù)考察Table3-9Using times of macroporous resin使川次數(shù)吸附率%83.5782.6180.9453.12由表3.9可

15、見,樹脂重復(fù)使用3次后,總黃酮吸附率下降,故AB.8大孔樹脂只宜重復(fù)使用3次。按照上述2.3條件采用相應(yīng)4倍數(shù)的樹脂柱,柱長度48cm,柱內(nèi)直徑5.2cm,將16mL濃度為37.56mg/mLl釣l艾蒿提取濃縮液按照上述純化條件經(jīng)過AB一8大孔樹脂純化,產(chǎn)品真空干燥后純度達(dá)69%。2.4黃酮分離純化結(jié)果與分析表3.10艾蒿黃酮純化產(chǎn)物結(jié)果分析Table310Results and analysis of refined products of FA由表3.10分析可知,石油醚和J下丁醇萃取效果不是很好,乙酸乙酯萃取分離FA的效果十分明顯,FA2黃酮含量達(dá)到78.28%。FA2經(jīng)過葡聚糖凝膠純化

16、后(FAS,黃酮含量達(dá)到99.16%。牛中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屆顧Ij學(xué)位論義3結(jié)論1研究表明,通過以上單因素實驗,在中心組合實驗基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面分析法得出了提取FA的最佳工藝組合:時間149min,乙醇濃度56%,溫度72,料液比1:20,提取2次。在此最佳工藝組合下FA的平均提取率可達(dá)91.2%。2AB.8大孔樹脂純化艾蒿黃酮的最佳條件:(樹脂柱長度48crn:柱內(nèi)直徑5.2cm;初始上樣液黃酮含量為37.56mg/mL上樣量為16mL,淋洗劑為pH4的蒸餾水,洗脫劑為pH4的50%乙醇,洗脫劑用量為5倍柱體積,樹脂可以重復(fù)使用3次,產(chǎn)品真空干燥后FAl純度達(dá)69.37%。3乙酸乙酯相(FA

17、2純度達(dá)78.28%,得率為2.64%;FA2經(jīng)過葡聚糖凝膠純化后(FA8,黃酮含量達(dá)到99.16%,得率為1.89%。艾薔贊酮的提取分離純化、結(jié)構(gòu)峪定及L抗瓴化憚研究第四章艾蒿黃酮的結(jié)構(gòu)鑒定本文旨在采用UV、IR、HPLC、HPLC.ESI/MS等現(xiàn)代分離檢測技術(shù),研究艾蒿黃酮的聚合度,基本組成單元,鏈的連接方式等結(jié)構(gòu)信息,進而對其進行結(jié)果鑒定。1材料與方法1.1材料、試劑與儀器.材料:艾蒿黃酮(FA即第三章所得到的艾蒿黃酮的葡聚糖凝膠純化物FAS。甲醇、乙酸為色譜純,其余試劑為國產(chǎn)分析純,水為去離子水。UV-1700紫外掃描儀SHIM ADZU同本島津公司470FT-IR Thermo N

18、ICOLET NEXUS Varian230型高效液相色譜(PDA檢測器Varian Co.,USA100系列液質(zhì)聯(lián)用儀Agilent Co.,USA Agilent1(DEl4915085DAD檢測器1.2實驗方法取一定量的艾蒿黃酮FAS樣品,用甲醇溶解,濃度為0.01mg/mL,在紫外光譜儀上掃描,掃描波長.(200nm.500nm。艾蒿黃酮與溴化鉀按2:100的比例混合,研磨壓片,采用傅立葉變換紅外光華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屙碩:學(xué)位論義譜儀分析。紅外光譜條件如下:掃描頻率:32times/s,掃描范圍:4000.400cm一。采用Varian230型高效液相色譜儀(PDA檢測器,Diamo

19、nsil C18 (4.6minxl50mmx5um色譜柱,檢測波長360rim,柱溫25.0C,進樣量101.tL,流速1.0mL/min,流動相:A為1%乙酸/水;B為甲醇。沈脫梯度:0-5min, 20%.37%B:5-25min,37%一50%B;25-35rain,50%一60%B;3545min,60%.90%B: 45.50min,90%B;50.55min,90%.20%B;55.60min,20%B。對FAS進行分析,以溶劑B溶解樣品進樣(Ma Y L et a1.,2001o采用Aglient1100Series LC/MSD Trap液質(zhì)聯(lián)用色譜儀,配有二元梯度泵, DA

20、D檢測器,柱溫箱和自動進樣器。Zorbax SB.C18色譜柱(150x2.1mm,51LLm,流速:0.2mL/min,進樣量4.0uL,檢測波長360nm。流動相:(A1%乙酸/水(B甲醇(Hughes et a1.2001。洗脫梯度:0.5min,20%.37%B;5-25min,37%.50%B; 25-35min,50%一60%B;35.45min,60%-90%B:45-50min,90%B;50-55min, 90%一20%B:55.60min,20%B。ESI方式離子化,采用負(fù)離子模式,霧化壓力為20psi,干燥氣體的流速為7.00mL/min,溫度為325,毛細(xì)管電壓為4Kv

21、;掃描范圍:1001000m/z(Jian Hart et a1.,2007;Cuyckens et a1.,2002。 華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屆顧lj學(xué)位論文2.3艾蒿黃酮的HPLC,HPLC.ESI/MS分析4030毫20102025Minutes圖4.3Sephadex LH-20純化物高效液相色譜圖Fig.4-3HPLC chromatogram ofsephadex LH20extractions of FA圖4_4FAS總離子流圖BPC士AIIMS chromatogram of refmed products of FA Fig.4-4 華中農(nóng)業(yè)人學(xué)2008屆碩I:學(xué)位論義過對艾蒿

22、黃酮進行的HPLC、HPLC.ESI/MS色譜分析,得出艾蒿中含有多種黃酮,HPLC.MS進一步證實了艾蒿中含有以芹菜素、槲皮素、香葉木素為苷元的黃酮,與報道的相符。艾篙黃酬的提取分離多b化、結(jié)構(gòu)搭定及l(fā)C抗瓴化十牛研究第五章艾蒿黃酮的抗氧化活性研究近年來,隨著對傳統(tǒng)合成抗氧化劑BHT,BHA,TBHQ等毒性問題的提出,天然抗氧化劑越來越受到食品飼料等行業(yè)的青睞,特別是植物源抗氧化劑因其具有來源廣泛、提取率高、抗氧化性強、與機體親和力強和安全性高等優(yōu)點,使天然抗氧化劑的研究逐漸成為熱點(Rene Torres et a1.,2006。其中最有研究價值的就是廣泛存在于植物體的黃酮類化合物(黃酮醇

23、、異黃酮、黃酮、黃烷酮以及黃酮類化合物的前體物(酚酸和兒茶酸等(朱宇旌等,2006。黃酮類化合物具有抗癌、抗病毒、抗菌、抗過敏、抗血管脆性和血小板聚集及抗糖尿病并發(fā)癥等多種生理活性與藥理作用,而這些生理活性是以黃酮類化合物的抗氧化活性為基礎(chǔ)的(趙雪梅等,2003。黃酮類化合物具有很強的抗氧化活性,如清除超氧陰離子、羥基自由基和過氧自由基等,同時能顯著提高超氧化物歧化酶(SOD和谷膚甘肽過氧化物酶(GSH.PX均等抗氧化酶的活性,對H202有明顯的抑制效應(yīng)(楊轉(zhuǎn)琴等,2006。1材料與方法1.1材料、試劑與儀器艾蒿黃酮:即第三章所得到的兩種不同類型的FA提取物(乙酸乙酯萃取物FA2、SephadexLH.20純化物FAS。昆明種小鼠,雄性,清潔級,體重20_29。購自湖北省疾控中心。碘化鉀分析純上?；瘜W(xué)試劑有限公司三氯甲烷分析純上?；瘜W(xué)試劑有限公司41 艾筒竹酮的提取分離鄉(xiāng)U化、結(jié)構(gòu)搭定及E抗鍛化件研究1.2實驗方法采用