分子發(fā)光分析法

1、第一頁，共99頁。第二頁，共99頁。較高激發(fā)態(tài)較高激發(fā)態(tài)基基 態(tài)態(tài)吸收能吸收能量量受激受激光輻射光輻射退激退激分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量分子在退激過程中以光輻射形式釋放能量第三頁，共99頁。熒光熒光熒光分析法熒光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法第四頁，共99頁。 采用高靈敏度的檢測系統(tǒng)可大大提高靈采用高靈敏度的檢測系統(tǒng)可大大提高靈敏度，檢測限熒光分析法比分光光度法低敏度，檢測限熒光分析法比分光光度法低24個數(shù)量級個數(shù)量級激發(fā)激發(fā)發(fā)射熒光發(fā)射熒光強強強強第五頁，共99頁。第六頁，共99頁。第七頁，共99頁。電子基態(tài)電子基態(tài)第一電子激發(fā)態(tài)第一電子激發(fā)態(tài)轉動能極躍遷轉動能極躍遷振動能級躍

2、遷振動能級躍遷電子能級躍遷電子能級躍遷第八頁，共99頁。 、n第九頁，共99頁。第十頁，共99頁。S0S1 S0T1 第十一頁，共99頁。S0S2S1T1第十二頁，共99頁。第十三頁，共99頁。 電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷輻射躍遷(發(fā)發(fā)光光)和和無輻射躍遷無輻射躍遷等方式失去能量；等方式失去能量；傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷輻射躍遷熒光熒光延遲熒光延遲熒光磷光磷光內轉移內轉移外轉移外轉移系間跨越系間跨越振動弛豫振動弛豫無輻射躍遷無輻射躍遷激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的

3、幾率大，發(fā)光強發(fā)光強度相對大。度相對大。第十四頁，共99頁。當當兩個電子能級兩個電子能級非?？拷灾疗湔駝幽芗売蟹浅？拷灾疗湔駝幽芗売兄丿B重疊時，時，S2 S1、T2-T1速率極大，速率極大， 10-14 10-12s 完成。完成。無論分子被激發(fā)到哪個激發(fā)單重態(tài)，均通過內轉換和振動弛無論分子被激發(fā)到哪個激發(fā)單重態(tài)，均通過內轉換和振動弛豫，躍回豫，躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。第十五頁，共99頁。第十六頁，共99頁。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光S0S1S2VR：振動馳豫：振動馳豫IC：內部轉換：內部轉換ISC：系間竄躍：系間竄躍第十七頁，共99頁

4、。（ 多為多為 S1 S0躍遷躍遷），第十八頁，共99頁。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 熒光熒光圖圖5-1 分子熒光光譜產生過程示意圖分子熒光光譜產生過程示意圖S0S1S2VR：振動馳豫：振動馳豫IC：內部轉換：內部轉換ISC：系間竄躍：系間竄躍第十九頁，共99頁。第二十頁，共99頁。T1S0ISCVRVRIC吸光吸光 吸光吸光 熒光熒光 磷光磷光圖圖5-1 分子熒光、磷光光譜產生過程示意圖分子熒光、磷光光譜產生過程示意圖S0S1S2VR：振動馳豫：振動馳豫IC：內部轉換：內部轉換ISC：系間竄躍：系間竄躍VR第二十一頁，共99頁。S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射

5、射磷磷光光系間跨越內轉換振動弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外轉換l l 2T2內轉換振動弛豫第二十二頁，共99頁。I固定固定固定測量波長為熒光（或磷光）最大固定測量波長為熒光（或磷光）最大發(fā)射波長發(fā)射波長 ，然后改變激發(fā)波長，然后改變激發(fā)波長，根據(jù)激發(fā)光波長，根據(jù)激發(fā)光波長對熒光（磷對熒光（磷光）強度光）強度I作圖得作圖得 激發(fā)光譜曲線激發(fā)光譜曲線。 激發(fā)：激發(fā)：excitated發(fā)射：發(fā)射：emission 激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大第二十三頁，共99頁。激發(fā)光譜曲線：激發(fā)光譜曲線： 吸收曲線：吸收曲線： 兩者在性質上是不同的兩者在性質上是不同的I固定

6、固定第二十四頁，共99頁。I固定固定固定激發(fā)光波長固定激發(fā)光波長由于不同物質具有不同的特征發(fā)射由于不同物質具有不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質鑒別熒光物質第二十五頁，共99頁。吸收峰熒光峰磷光峰第二十六頁，共99頁。第二十七頁，共99頁。 a. Stokes a. Stokes位移位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。振動弛豫消耗了能量。 b. .發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關 不管激發(fā)波長如何，分子受

7、激后可到達不同能層的激發(fā)態(tài)，不管激發(fā)波長如何，分子受激后可到達不同能層的激發(fā)態(tài)，但通過去活化（內轉換和振動弛豫），電子都是從第一電子激發(fā)但通過去活化（內轉換和振動弛豫），電子都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層。態(tài)的最低振動能層躍遷到基態(tài)的各個振動能層。 c. . 鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。）成鏡像對稱關系。 第二十八頁，共99頁。第二十九頁，共99頁。 基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似。能級分布

8、類似。激發(fā)：基態(tài)激發(fā)：基態(tài)第一激發(fā)態(tài)各振動能級，振動能級越第一激發(fā)態(tài)各振動能級，振動能級越 高，能級差越大，波長就越短。高，能級差越大，波長就越短。發(fā)射熒光：從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級發(fā)射熒光：從第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級基態(tài)的各基態(tài)的各 振動能級，基態(tài)的振動能級越高，其能量振動能級，基態(tài)的振動能級越高，其能量 差越小，波長就越長。差越小，波長就越長。吸收光譜中能級越高波長越短，發(fā)射光譜中能級越高，波吸收光譜中能級越高波長越短，發(fā)射光譜中能級越高，波長越長?；殓R像長越長?；殓R像第三十頁，共99頁。 基態(tài)上的零基態(tài)上的零振動能級與第一振動能級與第一激發(fā)態(tài)的振動能激發(fā)態(tài)的振動能級之間的躍遷幾級之

9、間的躍遷幾率最大，相反躍率最大，相反躍遷也然遷也然。 第三十一頁，共99頁。第三十二頁，共99頁。發(fā)熒光的分子數(shù)發(fā)熒光的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)激發(fā)態(tài)分子總數(shù)第三十三頁，共99頁。ifffKKK第三十四頁，共99頁。總之，總之，躍遷是產生熒光的主要躍遷類型。躍遷是產生熒光的主要躍遷類型。第三十五頁，共99頁。 0.11 205 278 0.29 286 3100.46 365 400苯苯萘萘蒽蒽 350菲菲線狀環(huán)結構比非線狀結構線狀環(huán)結構比非線狀結構的熒光波長長的熒光波長長第三十六頁，共99頁。 芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數(shù)能發(fā)生熒光熒光

10、多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定多環(huán)芳烴是重要的環(huán)境污染物，可用熒光法測定 3，4 - 苯并苯并芘是強致癌物芘是強致癌物第三十七頁，共99頁。熒光素：氧橋把兩熒光素：氧橋把兩個環(huán)固定在一個平個環(huán)固定在一個平面上，具有平面結面上，具有平面結構，強熒光物質構，強熒光物質酚酞：無氧橋把兩酚酞：無氧橋把兩個環(huán)固定，不能很個環(huán)固定，不能很好的共平面，為非好的共平面，為非熒光物質熒光物質第三十八頁，共99頁。反式：平面構型 強熒光體順式：非平面構型 非熒光體第三十九頁，共99頁。第四十頁，共99頁。第四十一頁，共99頁。第四十二頁，共99頁。第四十三頁，共99頁。第四十四頁，共99頁。第四十五頁

11、，共99頁。例：例： 苯酚苯酚離子化后，離子化后，熒光消失熒光消失pH1有有熒光熒光pH13無無熒光熒光第四十六頁，共99頁。例：例： 苯酚苯酚有熒光有熒光無熒光無熒光另外，表面活性劑也會影響熒光強度和特性第四十七頁，共99頁。 自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：內濾光中的一種，化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其：內濾光中的一種，化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產生自吸收；如蒽化合物。吸收光譜的長波長端重疊，產生自吸收；如蒽化合物。 內濾光作用內濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質發(fā)射的熒光，如：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質發(fā)射的熒光，如色氨酸中的重鉻酸鉀；色氨酸中的重鉻酸

12、鉀；第四十八頁，共99頁。第四十九頁，共99頁。第五十頁，共99頁。M 非輻射躍遷非輻射躍遷吸收hM發(fā)射熒光 hM M+熱熱 碰撞猝滅碰撞猝滅第五十一頁，共99頁。第五十二頁，共99頁。第五十三頁，共99頁。第五十四頁，共99頁。第五十五頁，共99頁。熒光池熒光強度檢測器IIA0lg將上式展開! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff第五十六頁，共99頁。! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320AAAIIff當當A0.05時，時，第五十七頁，共99頁。第五十八頁，共99頁。與分光光度計有兩點不同與分光光度計有兩點不同兩個單色器兩個單色器檢測器與激發(fā)光

13、互成直角檢測器與激發(fā)光互成直角光源光源第一單色器第一單色器激發(fā)單色器激發(fā)單色器液池液池檢測器檢測器第二單色器第二單色器發(fā)射單色器發(fā)射單色器檢測器檢測器放大器及記錄器放大器及記錄器第五十九頁，共99頁。第六十頁，共99頁。應用最廣泛的一種光應用最廣泛的一種光源，可發(fā)射源，可發(fā)射250800nm很強的連續(xù)光源很強的連續(xù)光源第六十一頁，共99頁。第六十二頁，共99頁。第六十三頁，共99頁。第六十四頁，共99頁。第六十五頁，共99頁。 根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步掃描可分為固定波長差同步掃描可分為固定波長差(ll)和固定能

14、量差及可變波長三種：和固定能量差及可變波長三種：1、固定波長差同步掃描熒光法、固定波長差同步掃描熒光法 ll l lex- l lem常數(shù)常數(shù)2、固定能量差同步掃描熒光法固定能量差同步掃描熒光法 使發(fā)射單色器與激發(fā)單色器之間保持一個恒定的波數(shù)差使發(fā)射單色器與激發(fā)單色器之間保持一個恒定的波數(shù)差3、可變波長同步掃描熒光法、可變波長同步掃描熒光法 使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時進行掃描使兩單色器在掃描過程中以不同的速率同時進行掃描常數(shù)710)11(emexll第六十六頁，共99頁。 同步掃描技術可簡化光譜，譜帶變窄同步掃描技術可簡化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率。，減少光譜重疊，提

15、高分辨率。 合適的合適的ll可可減少光譜重疊：減少光譜重疊：酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴重重疊，但發(fā)射光譜嚴重重疊，但ll15nm60nm60nm時，只時，只顯示顯示色氨酸的特征光譜，實現(xiàn)分別測定。色氨酸的特征光譜，實現(xiàn)分別測定。第六十七頁，共99頁。第六十八頁，共99頁。第六十九頁，共99頁。第七十頁，共99頁。磷光儀器在熒光儀磷光儀器在熒光儀樣品池上增加磷光樣品池上增加磷光配件：配件：低溫杜瓦瓶低溫杜瓦瓶和斬光片和斬光片。如右圖。如右圖所示。斬光片的作所示。斬光片的作用是利用其分子受用是利用其分子受激所產生的熒光與激所產生的熒光與磷光的壽命

16、不同獲磷光的壽命不同獲取磷光輻射取磷光輻射第七十一頁，共99頁。第七十二頁，共99頁。第七十三頁，共99頁。第七十四頁，共99頁。第七十五頁，共99頁。第七十六頁，共99頁。缺VB2會得口角炎、舌炎、唇炎、脂溢性皮炎維生素維生素B2第七十七頁，共99頁。第七十八頁，共99頁。第七十九頁，共99頁。第八十頁，共99頁。第八十一頁，共99頁。第八十二頁，共99頁。激發(fā)態(tài)分子數(shù)發(fā)射的光子數(shù)參加反應的分子數(shù)激發(fā)態(tài)分子數(shù)參加反應的分子數(shù)發(fā)射光子的分子數(shù)frCL激發(fā)態(tài)分子的化學效率化學效率激發(fā)態(tài)分子的發(fā)光效率發(fā)光效率取決于發(fā)光所依據(jù)的化學反應本身取決于發(fā)光所依據(jù)的化學反應本身第八十三頁，共99頁。dtdc

17、tICLCL)(對下列化學發(fā)光反應對下列化學發(fā)光反應 A +B C* +D C + h第八十四頁，共99頁。Ackdtdc1nt 時刻的發(fā)光強度與該時刻的分析物濃度成正比時刻的發(fā)光強度與該時刻的分析物濃度成正比n化學發(fā)光總強度與分析物濃度呈線性關系。常用發(fā)光總化學發(fā)光總強度與分析物濃度呈線性關系。常用發(fā)光總強度來定量分析強度來定量分析ACLCLCLcdtdtdcdtIS發(fā)光總強度ACLCLCLckdtdctI1)(第八十五頁，共99頁。第八十六頁，共99頁。NHNHOONH22NHCOOCOO*OH-COOCOONH2+hv氧化劑（氧化劑（ H2O2 ）425 nm 反應產生的化學能被產物氨基鄰苯二甲