免疫組化的原理和步驟

1、精品文檔免疫組織化學(xué)的概念：免疫組化是利用抗原與特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記的顯色劑( 熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原( 多肽和蛋白質(zhì) ) ，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)。免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的有哪些？免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單抗體和多抗體。單抗體是一個(gè)B 淋巴細(xì)胞分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B 淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些？實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍

2、切片，后者包括組織印片、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法，對(duì)于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；還能長(zhǎng)期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進(jìn)行抗原修復(fù)， 是免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。石蠟切片為什么要做抗原修復(fù)？有哪些方法？石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進(jìn)行IHC 染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法，高壓加

3、熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復(fù)液是 pH6.0 的 0.01 mol/L 的檸檬酸鹽緩沖液。免疫組化常用的染色方法有哪些？根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原( 抗體 ) 在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位，其中生物素 抗生物素染色法最常用。抗體交叉反應(yīng)的原因：指抗體除與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外還與其它抗原發(fā)生反應(yīng)。產(chǎn)生的原因有以下幾個(gè)方面：1. 抗原特異性指用于免疫動(dòng)物的抗原性物質(zhì)中含有多種抗原分子，它引起動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)多種抗原分子特異性的相應(yīng)抗體。 任何其它物質(zhì)只要含有

4、一種或多種與上述物質(zhì)相同的抗原分子，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)。2. 共同決定簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。3. 決定簇相似，兩種不同的抗原決定簇，如果結(jié)構(gòu)大致相同，由于空間構(gòu)象關(guān)系，某一決定簇的相應(yīng)抗體可以與大致相同的決定簇發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然抗原一抗體之間構(gòu)象相似時(shí)的結(jié)合力小于吻合時(shí)的結(jié)合力。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)一、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的概述* 免疫細(xì)胞化學(xué) (immunocytochemistry, ICC)- 是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑( 熒光素、酶、金屬離子、 同位素 ) 顯色來(lái)確定細(xì)胞內(nèi)抗原的成分 ( 主要是多肽和蛋白質(zhì) ) ，對(duì)

5、其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為。1 歡迎下載精品文檔( 一 ) 對(duì)抗原和抗體的要求* 具有特異性高和親和力強(qiáng)的抗體是實(shí)驗(yàn)成功的首要條件。- 對(duì)抗體的要求：純度高、比活性強(qiáng)；* 高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。- 對(duì)抗原的要求：純度高，免疫原性強(qiáng)，穩(wěn)定無(wú)變化。( 二 ) 抗原 (antigen, Ag)* 抗原的概念：凡是在機(jī)體內(nèi)引起體液免疫和 ( 或 ) 細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱為抗原?？乖哂袃蓚€(gè)方面的特性：- 免疫原性：引起機(jī)體產(chǎn)生抗體和( 或 ) 致敏淋細(xì)胞的特性；- 免疫反應(yīng)性：抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性。* 根據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為：-

6、完全抗原 ：分子量較大，一般在 10kDa 以上，并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成。* 免疫原性最強(qiáng)的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。- 半抗原 ：又稱為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。* 半抗原必需與載體結(jié)合，才能獲得免疫原性。載 體 ：通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。- 常用的載體有鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin， KLH)、牛血清白蛋白(bovineserum albumin, BSA)、卵白蛋白 (Ovalbumin ， OVA)等。- 用戊

7、二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過(guò)功能基團(tuán) -NH2、 -COOH等將半抗原結(jié)合到載體上。結(jié)合比例為 5kDa 結(jié)合 5 25 個(gè)分子的小肽。（三）抗體(antibody, Ab)1、抗體的概念：* 機(jī)體受到抗原刺激后， 由漿細(xì)胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，被稱為抗體。- 抗體主要存在于血清內(nèi)；- 抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。- 免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，既 IgG、 IgD 、IgE 、 IgA 、IgM。2、免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體：?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體。* 單克隆抗體：是一個(gè) B 淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，是應(yīng)用細(xì)胞融合雜交

8、瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備的。- 特異性強(qiáng)、抗體產(chǎn)量高。* 多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè) B 淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。- 特異性低，會(huì)產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)。- 多克隆抗體廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機(jī)會(huì)。- 抗原與抗體的結(jié)合，要求量保持一定比例，當(dāng)抗原或抗體過(guò)量時(shí)，是不能聚合成大顆粒。3、抗體的制備 多克隆抗體的制備* 動(dòng)物的選擇。2 歡迎下載精品文檔* 佐劑 (adjuvant)* 免疫方法* 免疫劑量* 抗體效價(jià)的測(cè)定* 放血或定期抽血(1) 動(dòng)物的選擇選擇什么動(dòng)物來(lái)免疫取決于：* 所需抗血清的量- 小鼠只能提供 1.0 1.

9、5ml 的血液，而山羊能提供幾升。* 能供免疫用的抗原量- 小鼠 50 g 足夠，而山羊需要幾毫克。(1) 動(dòng)物的選擇 ( 續(xù) )* 動(dòng)物的品系：免疫動(dòng)物與提供抗原的動(dòng)物之間的種系差異越大越好。- 例如哺乳動(dòng)物的抗原可選擇非哺乳動(dòng)物來(lái)制備抗體。- 常用的動(dòng)物有兔、羊、馬、豬等，以兔( 新西蘭兔，年輕，健壯，體重在2.5kg 左右，雄性 ) 為最常用。(2) 佐劑 (adjuvant)* 一般可溶性抗原注射后，迅速?gòu)淖⑸洳课粩U(kuò)散、吸收代謝。佐劑可延長(zhǎng)潴留時(shí)間，且延長(zhǎng)免疫刺激作用。因此在制備抗體的過(guò)程中，常將抗原和佐劑一起注射。* 最常用的佐劑是弗氏佐劑，又分為:- 弗氏不完全佐劑 (Freund

10、's incomplete adjuvant)- 弗氏完全佐劑 (Freund's complete adjuvant)弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant, FIA)* 是由油劑 ( 石蠟油或植物油) 與乳化劑 ( 羊毛脂或Tween80)混合而成，比例為1:1 、 2:1 、3:1 或 5:1 ，可根據(jù)需要而定，通常2:1 。* 使用時(shí)與水溶性抗原按 1:1 比例充分混合，使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。弗氏完全佐劑 (Freund's complete adjuvant, FCA)* 在弗氏不完全佐劑中加入活卡介苗或死

11、的結(jié)核分枝桿菌( 終濃度為2 20mg/ml) ，即成為FCA。* 免疫動(dòng)物時(shí)，將弗氏佐劑與抗原按體積1:1混合乳化后 ( 油包水 ) 注入動(dòng)物。- 一般首次注射時(shí)用完全佐劑乳化，第二次或第三次注射時(shí)用不完全佐劑或不用佐劑。佐劑與抗原乳化的方法* 研磨法：適于制備大量的佐劑抗原- 先將不完全佐劑加熱，取1.73ml 放人無(wú)菌玻璃研缽內(nèi)；緩緩滴入0.23ml 活卡介苗，邊滴邊按同一方向研磨，使菌體完全分散。- 按同樣方法滴人抗原，每加一滴應(yīng)研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，應(yīng)成為乳白色粘稠的油包水乳劑。* 缺點(diǎn)：研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大，對(duì)微量或難得抗原不宜采用。佐

12、劑與抗原乳化的方法 ( 續(xù) )。3 歡迎下載精品文檔* 注射器混合法- 將等量的完全佐劑和抗原分別吸人兩個(gè) 5ml 注射器內(nèi)，然后插入三通管內(nèi)，交替推動(dòng)針管混勻，往復(fù)操作直至形成粘稠的乳劑為止。* 優(yōu)點(diǎn)：無(wú)菌操作，節(jié)省抗原或佐劑。* 缺點(diǎn)：不易乳化，時(shí)間長(zhǎng)。佐劑與抗原乳化的方法 ( 續(xù) )* 快速乳化法：利用超聲波粉碎器可快速乳化抗原和佐劑混合物。- 將抗原和佐劑按所需量加入一中，置于超聲波粉碎器上，粉碎頭浸入液面下0.5cm ，離瓶底 0.5cm 左右，以免打碎。- 每次乳化 10 15s ，然后置冰箱lmin左右。反復(fù)乳化34 次即可完全乳化。管內(nèi)殘余量 800r/min 離心 5 10m

13、in 收集。* 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、節(jié)省材料。乳化劑的鑒定* 判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上( 冷水中 ) ，如能長(zhǎng)時(shí)間保持圓珠形而不散開(kāi)，表示乳化達(dá)到要求。(3) 免疫方法 免疫途徑* 常有靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)、淋巴結(jié)、腳掌等注射。* 一般采用多點(diǎn)注射方法- 常在足、掌、腋窩淋巴結(jié)周圍、背部?jī)蓚?cè)、頜下、耳后等處的皮內(nèi)或皮下。- 皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于提高抗體的效價(jià)。(3) 免疫方法 免疫途徑 ( 續(xù) ) * 幾點(diǎn)說(shuō)明：- 大動(dòng)物一般不用腹腔注射- 顆粒抗原和使用佐劑時(shí)不能靜脈注射- 抗原寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法，只需10 100 g 抗原即可獲得較好的免疫

14、效果。- 皮內(nèi)注射較困難，特別是天冷時(shí)更難注入。(3) 免疫方法 次數(shù)及間隔時(shí)間* 次數(shù)一般為2 3 次 ( 初次免疫和加強(qiáng)免疫)- 首次注射后， 10 15 天再加強(qiáng)注射；- 劑量同首次或?yàn)槭状蔚囊话?，用不全佐劑或不用佐劑? 間隔時(shí)間，一般而言，動(dòng)物越大，間隔越長(zhǎng)- 豚鼠、大鼠為7 8 天，兔子為10 15 天，羊?yàn)?4 28 天；- 第三次注射的間隔時(shí)間更長(zhǎng)些，效果更好。舉例 1：家兔的免疫* 初次免疫- 用 50 200 g Ag 加入 FCA，在背部皮下注射 6 8 點(diǎn)，每點(diǎn) 0.1 0.2ml ，也可肌肉內(nèi)或皮內(nèi)注射；* 兩周后，加強(qiáng)免疫- 將 50 200 g Ag 于 PBS或

15、 FIA 中，在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內(nèi)注射；* 抗體效價(jià)的檢測(cè)：加強(qiáng)免疫一周后，耳緣靜脈采血。4 歡迎下載精品文檔- 抗體效價(jià)測(cè)定可用環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、 瓊脂雙向擴(kuò)散法等方法。 前者抗體效價(jià)在 1:4000 以上，后者在 1:16 以上，即可采血，取血清進(jìn)一步提純。舉例 2：微量抗原淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫家兔* 一般選擇2.5 3.0kg 的新西蘭種公兔- 先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑0.2ml( 卡介苗每兔合 5mg)；-10 天后，見(jiàn)胭窩淋巴結(jié)腫大，然后將抗原注射至腫大的淋巴結(jié)內(nèi)，第一次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化；- 以后每隔20 天用不完全福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強(qiáng)2 次，各次注射的抗

16、原均為25 50 g；- 末次注射兩周后兔耳放血測(cè)價(jià)( 可達(dá) 1:128) 。舉例 3：豚鼠和大鼠的免疫* 初次免疫- 用 10 100 g Ag 加入 FCA，在背部皮內(nèi)注射4 6 點(diǎn)，每點(diǎn) 0.lml，也可肌肉內(nèi)或皮下注射；* 加強(qiáng)免疫- 每隔 7 8 天，將 10 50 g Ag 于 PBS 或 FIA 中。在肌肉、皮下或靜脈注射；* 抗體效價(jià)的檢測(cè)(4) 免疫劑量* 抗原性強(qiáng)的抗原量應(yīng)小，過(guò)大反會(huì)引起免疫抑制；* 免疫周期長(zhǎng)的動(dòng)物可少量多次注射，短的可大量少次。(4) 免疫劑量 ( 續(xù))* 各種動(dòng)物首次免疫抗原劑量和加強(qiáng)免疫的劑量(5) 抗體效價(jià)的檢測(cè)多采免疫雙向擴(kuò)散法【基本原理】*

17、指抗原和抗體在同一凝膠內(nèi)都擴(kuò)散，彼此相遇后形成特異性的沉淀線。- 將抗原與抗體分別加入同一凝膠板中兩個(gè)相隔一定間距的小孔內(nèi)，使兩者進(jìn)行相互擴(kuò)散，當(dāng)抗原抗體濃度之比相適宜時(shí)，彼此相遇形成一白色弧狀沉淀線。* 優(yōu)缺點(diǎn)：簡(jiǎn)便，但敏感性較低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。免疫雙向擴(kuò)散法的操作步驟* 將玻璃板用水洗凈后用 75乙醇沖洗，晾干后放在水平臺(tái)上備用。* 將 1 agar 融化后，置 56水浴。* 在玻璃板上鋪膠，約 1.5mm 厚，凝固后打孔( 直徑 3rnm) ，孔間距 10mm。* 中心孔加 5 l 抗原樣品，周圍孔內(nèi)每孔加 5l 抗血清 ( 抗體預(yù)先作系列倍比稀釋即1:2 、1:4 、1:8 、 1

18、:16 、 1:32 等比例 ) 。* 凝膠板置濕盒內(nèi)，室溫?cái)U(kuò)散24h。* 觀察結(jié)果?？贵w效價(jià)檢測(cè)的其它方法* 環(huán)狀沉淀試驗(yàn)，需較多的抗血清，現(xiàn)已很少用；* 對(duì)流免疫電泳，比瓊脂免疫雙擴(kuò)散法敏感，較簡(jiǎn)便、實(shí)用；。5 歡迎下載精品文檔* 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 。放血或定期抽血常用以下 3 種方法* 頸動(dòng)脈放血法：放血量較多，動(dòng)物不易中途死亡。例如：2.5kg 白兔可放血約80ml。家兔、山羊、綿羊等動(dòng)物采血常用此法。* 心臟采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、雞等小動(dòng)物，但操作不當(dāng)易引起動(dòng)物死亡。* 靜脈采血：家兔可用耳緣靜脈采血；山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈采血，這種放血法可隔日 1

19、 次，有時(shí)可采集多量血液。放血或定期抽血 ( 續(xù) )* 采血過(guò)程中，動(dòng)作要輕柔，盡量避免溶血* 血液凝固后，及時(shí)離心收集血清，否則細(xì)胞溶解釋放的雜蛋白( 例如蛋白水解酶) 將污染抗體并將抗體水解，降低效價(jià)；* 加疊氮化鈉，分裝，低溫保存，也可加一定的保護(hù)劑如BSA、甘油等。二、組織和細(xì)胞標(biāo)本的制備* 標(biāo)本制備恰當(dāng)，是免疫組化成功的首要條件* 免疫組化對(duì)組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求- 保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)；- 在原位最大程度地保持待測(cè)抗原 ( 或抗體 ) 的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。* 免疫組化的組織和細(xì)胞標(biāo)本，制作流程與常規(guī)處理方法基本相同，但對(duì)組織、細(xì)胞的處理又有其特殊要求

20、及注意事項(xiàng)。- 各種抗原由于其含量及特性的差異對(duì)標(biāo)本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用于本實(shí)驗(yàn)的最佳方法。免疫組化中常用的組織和細(xì)胞標(biāo)本* 組織標(biāo)本- 石蠟切片- 冰凍切片* 細(xì)胞標(biāo)本- 組織印片- 片( 細(xì)胞爬片 )- 細(xì)胞涂片( 一) 石蠟切片* 石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法- 最大優(yōu)點(diǎn)是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察；- 石蠟塊還能長(zhǎng)期存檔，供回顧研究。* 石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響，但可通過(guò)某些措施予以改善，因而它是大多數(shù)免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事項(xiàng)* 標(biāo)本新鮮： 一般在 2h 以內(nèi)進(jìn)行， 超過(guò)

21、 2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴(yán)重彌散。6 歡迎下載精品文檔* 取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時(shí)應(yīng)有抗原陽(yáng)性和陰性區(qū)，以形成自身對(duì)照。- 細(xì)胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時(shí)應(yīng)盡可能避開(kāi)壞死區(qū)。1、取材的特殊要求及注意事項(xiàng)( 續(xù) )* 避免擠壓：取材時(shí)組織受擠壓可使邊緣部細(xì)胞形態(tài)改變并加深非特異著色，因而取材時(shí)應(yīng)使用鋒利的刀刃；- 鑷取組織動(dòng)作要輕；- 經(jīng)窺鏡直接鉗取的組織往往有過(guò)度擠壓，觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)有所考慮。2、固定及常用的固定液* 取材后的組織需立刻投于固定劑中- 固定使組織和細(xì)胞

22、的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，防止組織自溶或異溶，以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)；- 對(duì)免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。* 常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點(diǎn)。- 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）- 醇類（常用乙醇）- 其它 （丙酮）(1) 醛類* 甲醛 ( 福爾馬林 ) 應(yīng)用最廣- 原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。- 優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，組織收縮少。- 缺點(diǎn)：* 甲醛放置過(guò)久可氧化為甲酸，使溶液pH 降低，影響染色；* 醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙；*

23、分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘娜旧Y(jié)果。- 注意事項(xiàng)：* 縮短固定時(shí)間，降低固定溫度(4 C)，為此組織塊不宜過(guò)厚。* 改用中性緩沖福爾馬林，以pH值 7.2 7.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10甲醛固定液，減少固定液pH的變化。* 固定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。* 切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預(yù)處理使抗原再現(xiàn)( 抗原修復(fù) ) 。* 戊二醛：- 穿透性強(qiáng)，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，但對(duì)抗原有一定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。* 多聚甲醛 ( 常用 4%)：- 可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。7 歡迎下載精品文

24、檔* 主要檢測(cè)組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇 (CD) 、主要組織相容性抗原等。(2) 醇類* 最常用的醇類固定劑是乙醇。- 其固定作用：使細(xì)胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。- 優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存好。- 缺點(diǎn)：* 脫水性強(qiáng)，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)(2h 內(nèi) ) 。* 乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過(guò)程中，溫育時(shí)間長(zhǎng)，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度。(3) 其它固定劑* 丙酮：- 對(duì)抗原性的保存好，但脫水性更強(qiáng)，較少用于組織標(biāo)本，但細(xì)胞爬片常用丙酮固定。3、抗原修復(fù) 原因* 常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，結(jié)果

25、使得：- 抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇；- 蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。* 要求：在染色時(shí)，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。3、抗原修復(fù) 方法* 化學(xué)方法* 加熱方法- 水浴加熱法- 微波照射法- 高壓加熱法- 酸水解法(1) 化學(xué)方法* 主要是通過(guò)一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。- 胰蛋白酶：一般使用濃度為 0.05 0.1 ，消化時(shí)間為 37 C， 10 40min，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示；- 胃蛋白酶：一般使用濃度為 0.1% 0.4 ，消化時(shí)間為 37 C、 30 180min，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。* 例如： Laminin 、 CollagenIV(2) 水浴加熱法* 將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)10 15 分鐘。- 優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，適用于所有的實(shí)驗(yàn)室，- 缺點(diǎn)：對(duì)封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。(3) 微波照射法* 將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱至95以上， 持續(xù) l0 15 分鐘， 冷。8 歡迎下載精品文檔卻后，按免疫組化染色步驟進(jìn)行。* 此方法由于微波場(chǎng)內(nèi)極性分子、離子高速運(yùn)動(dòng)，撞擊交聯(lián)的網(wǎng)鏈，使抗原異常的構(gòu)想恢復(fù)正常，且因分子運(yùn)動(dòng)產(chǎn)熱、效率高、時(shí)間短，對(duì)抗原再現(xiàn)效果好。(4) 高