pET原核表達系統(tǒng)簡介

1、目錄目錄 PET系統(tǒng)是有史以來在 E.coli中克隆表達重組蛋白的功能最強大的系統(tǒng)。目的基因被克隆到 PET質(zhì)粒載體上，受噬菌體 T7強轉(zhuǎn)錄及翻譯(可選擇)信號控制；表達由宿主細胞提供的T7 RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7 RNA 聚合酶機制十分有效并具選擇性：充分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白；誘導(dǎo)表達后僅幾個小時，目的蛋白通?？梢哉嫉郊毎偟鞍椎?0%以上。PETPET系統(tǒng)概況系統(tǒng)概況Question：原核表達系統(tǒng)中，哪種載體最好 ？ 選擇選擇PETPET載體：載體：PETPET系統(tǒng)的優(yōu)點：系統(tǒng)的優(yōu)點：PETPET系統(tǒng)操作流程：系統(tǒng)操作流程：PETPET系統(tǒng)的組成：系統(tǒng)的組成：制備插

2、入制備插入DNADNA： 限制性消化和膠純化是制備插入片段的限制性消化和膠純化是制備插入片段的常規(guī)方法，常規(guī)方法，PCR可用于分離可用于分離/ 修飾修飾PET載體克載體克隆的目的基因，注意以下要點可以最大限度隆的目的基因，注意以下要點可以最大限度地降低發(fā)生錯誤的幾率：地降低發(fā)生錯誤的幾率：1、采用高保真酶、采用高保真酶2 、盡量減少、盡量減少 PCR循環(huán)數(shù)循環(huán)數(shù) 3、增加模板、增加模板 DNA濃度濃度 4、增加引物濃度、增加引物濃度將插入片段克隆到將插入片段克隆到PETPET載體上：載體上： 該過程包括連接和轉(zhuǎn)化非表該過程包括連接和轉(zhuǎn)化非表達宿主菌，以及分析構(gòu)建成功的達宿主菌，以及分析構(gòu)建成功

3、的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后，重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后，質(zhì)粒可轉(zhuǎn)入表達型菌株進行蛋白質(zhì)?？赊D(zhuǎn)入表達型菌株進行蛋白表達生產(chǎn)。表達生產(chǎn)。轉(zhuǎn)化表達宿主菌轉(zhuǎn)化表達宿主菌A. 轉(zhuǎn)化表達菌株轉(zhuǎn)化表達菌株為了轉(zhuǎn)化入表達用宿主菌株（如DE3 溶原菌），先要準備合適的感受態(tài)細胞，選用經(jīng)無菌水或TE緩沖液稀釋50倍的質(zhì)粒1l（約1ng），按公司的操作流程轉(zhuǎn)化步驟進行操作，單個克隆劃線轉(zhuǎn)化和甘油保存。B. DE3 溶原菌的誘導(dǎo)溶原菌的誘導(dǎo)若目標質(zhì)粒已存在于 DE3 溶原菌中，在生長培養(yǎng)基中加入IPTG 即可誘導(dǎo)目的DNA的表達。對于帶普通T7 啟動子的PET 重組子，終濃度為0.4mM 的IPTG 可以實現(xiàn)完

4、全誘導(dǎo)，而帶有T7lac啟動子的載體則需要終濃度為1mM 的IPTG 才能完全誘導(dǎo)。誘導(dǎo)的具體操作見公司操作流程。在一些 DE3宿主菌中通過調(diào)節(jié)IPTG的濃度可以改變蛋白表達的水平。RosettaTM(DE3)，TunerTM(DE3)和OrigamiTM B (DE3)菌株都包含了lacY1 突變，它們都消除了乳糖通過lac 透性酶進入細胞的主動運輸。因此這些菌株對于培養(yǎng)基中的乳糖不敏感，IPTG 對所有細胞的誘導(dǎo)更為均衡。當(dāng)采用這些菌株時，IPTG 的濃度應(yīng)在25M-1mM 之間選擇，確定最佳IPTG濃度使目的蛋白達到最佳的活性和溶解性。優(yōu)化表達條件：優(yōu)化表達條件：在 E.coli中表達的

5、重組蛋白經(jīng)常以聚集的形式表達，被稱作包涵體包涵體。即使在形成包涵體時，還是有一部分目的蛋白是溶解的。由于PET 系統(tǒng)的高表達水平，即使有大量的目的蛋白聚集形成包涵體，也會有相當(dāng)多的可溶性目的蛋白存在。在通常情況下，降低蛋白合成速率，如降低誘導(dǎo)培溫度及在基本培養(yǎng)基中生長都會使目的蛋白的可溶性增加。在許多應(yīng)用中需要目的蛋白以可溶及活性形式存在。A. A. 增加蛋白溶解性及折疊增加蛋白溶解性及折疊 多數(shù)氨基酸都有一個以上的密碼子，對E.coli密碼子應(yīng)用情況的分析表明一些密碼子很少使用。尤其是Arg密碼子AGA,AGG,CGG,CGA,Ile密碼子AUA,Leu密碼子CUA,Gly密碼子GGA和Pr

6、o密碼子CCC很少被用到。當(dāng)異源目的基因的mRNA在E.coli中過表達時，tRNA的數(shù)量直接反映了mRNA的密碼子偏倚性。由于一個或多個tRNA的稀有或缺少可能導(dǎo)致翻譯的停止。不充足的tRNA庫可能導(dǎo)致翻譯延遲、成熟前翻譯終止、翻譯移碼和氨基酸錯配。RosettaTM菌株被用來增加含有稀有Arg密碼子AGG和AGA，Ile密碼子AUA，Leu密碼子CUA,Pro密碼子CCC和Gly密碼子GGA目的蛋白的表達。tRNA由一個與pET載體相容的氯霉素抗性質(zhì)粒(以pACYC為骨架)帶有的自身啟動子所表達。含有pLysS的Rosetta菌株在帶有T7溶菌酶相同骨架上帶有編碼稀有密碼子的基因。Rose

7、tta菌株是lon和ompT蛋白酶缺陷型的一個B-衍生菌。RosettaBlueTM和Rosetta-gamiTM菌株分別衍生于K-12 NovaBlue菌株和Origami菌株。RosettaBlue還具有高轉(zhuǎn)化效率，以及由高水平lac阻遏子(lacIq)所帶來的嚴緊性控制。Rosetta-gamiTM菌株是trxB/gor突變株，通過形成二硫鍵促進蛋白折疊（二硫鍵形成及可溶性增強）。Rosetta菌株相當(dāng)適合用于表達那些含有E.coli稀有密碼子基因的目的蛋白。B.B.稀有密碼子稀有密碼子PBR322質(zhì)粒及其衍生型（包括PET載體）在宿主菌中相當(dāng)穩(wěn)定，即使在沒有抗生素壓力的情況下培養(yǎng)數(shù)代，

8、大部分宿主菌中仍保有這些質(zhì)粒。如果克隆入質(zhì)粒的外源基因產(chǎn)物對宿主菌具有毒性，就會遇到質(zhì)粒不穩(wěn)定的問題。PETcocoTM系統(tǒng)通過降低PETcoco的拷貝數(shù)直至每個細胞中僅一個拷貝來降低基礎(chǔ)表達水平（Sektas and Szybalski,2002）。毒性極大的基因產(chǎn)物也可以在該系統(tǒng)中穩(wěn)定存在并表達。在PET系統(tǒng)中，可在菌株生長已受損害的情況下維持質(zhì)粒的存在和一定表達水平；缺乏質(zhì)粒的細胞可能由于質(zhì)粒拷貝數(shù)的降低或其他原因，其數(shù)量有所增加。在這種情況下，若沒有選擇壓力，不含質(zhì)粒的細胞將很快生長。如果要使大部分細胞都含有質(zhì)粒，培養(yǎng)基中一定不能沒有抗生素。C.C.毒性基因及質(zhì)粒穩(wěn)定性毒性基因及質(zhì)粒穩(wěn)定性目的蛋白的純化目的蛋白的純化 蛋白純化的方法取決于多種因素，包括目的蛋白的屬性，細胞內(nèi)形成