葉酸代謝能力基因檢測(cè)操作流程

1、精品文檔MTHFR C677T , MTHFR A1298C, MTRR A66G基因檢測(cè)操作流程實(shí)驗(yàn)流程一、操作步驟適用儀器： 普通 PCR儀樣本要求： EDTA抗凝劑的靜脈全血 （ 100l ），室溫保存不超過 7 天， 2 8保存不超過 1 個(gè)月， -20 保存不超過 3 個(gè)月，反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次； DNA的濃度應(yīng)不低于 5ng/ l， A260/ A 280應(yīng)在 1.62.0 之間。有血塊的樣本需經(jīng)勻漿處理或用組織研磨儀研磨處理后再進(jìn)行全血DNA的提取。檢驗(yàn)方法：（試劑盒中的檢本測(cè)卡、陽(yáng)性/ 陰性對(duì)照卡上標(biāo)識(shí)解釋如下：M表示突變型， WT表示野。1 歡迎下載精品文檔生型， C表

2、示質(zhì)控線， T 表示檢測(cè)線。）A： 樣本 DNA的制備試劑盒準(zhǔn)備工作：1、清洗液 BW-I：用 50 ml 量筒分別移取 35 ml 無(wú)水乙醇（分析純）和 35 ml 異丙醇加入至清洗液 BW-I 試劑瓶中，顛倒混合均勻，在試劑瓶上標(biāo)明 “已加入醇 ”和日期，備用。2、清洗液 BW-II ：用 50 ml 量筒移取 49 ml 無(wú)水乙醇加入至清洗液BW-II 試劑瓶中，顛倒混合均勻，在試劑瓶上標(biāo)明 “已加入醇 ”和日期，備用。3、蛋白酶 K 準(zhǔn)備：取出蛋白酶K，室溫解凍，渦旋混勻后備用。4、磁性微粒準(zhǔn)備：將磁性微粒渦旋混勻，保證均一。實(shí)驗(yàn)操作步驟：1.將 20 l 蛋白酶 K 溶液加入 2 m

3、l離心管的管底。依次加入100 l 全血、 200 l 裂解液BL，用渦旋振蕩器混合15 sec( 以下簡(jiǎn)稱渦旋混勻 ) ， 56 水浴 20 min 。2. 向步驟 1 裂解處理的樣品中依次加入 300 l 結(jié)合液 BI 、25 l 的磁性微粒 （移取前必須充分渦旋混勻），渦旋混勻，室溫靜置 5 min 。磁性分離 5 min ，棄上清。3. 從磁性分離器上取出離心管， 加入 400 l 清洗液 BW-I，渦旋混勻，磁性分離至上清澄清 （期間上下顛倒數(shù)次，以清洗離心管管壁） ，棄上清；重復(fù)本步操作，以 400l 清洗液 BW-I 重復(fù)清洗一次。4. 從磁性分離器上取出離心管， 加入 400

4、l 清洗液 BW-II ，渦旋混勻，磁性分離至上清澄清（期間上下顛倒數(shù)次，以清洗離心管管壁） ，棄上清（盡可能棄去所有的清洗液 BW-II ）。5. 打開離心管蓋，將其室溫晾干 5 min 。6. 從磁性分離器上取下離心管，向管中加入 100 l 洗脫液 ES，渦旋混勻， 56水浴 5 min 。7. 將離心管置于磁性分離器上，磁性分離至上清澄清。將上清液（分離純化得到的 DNA溶液）轉(zhuǎn)移到 2 ml 離心管中，直接用于下游實(shí)驗(yàn)或于 -20 保存?zhèn)溆?。B： PCR擴(kuò)增液準(zhǔn)備（1）每人份需做兩個(gè)反應(yīng)， 取兩個(gè)無(wú)菌 0.2ml PCR薄壁管，在 PCR薄壁管管蓋上依次標(biāo)有M、WT。（2）將試劑從

5、-20 取出平衡至室溫，瞬時(shí)離心。在標(biāo)有M的管中加入 29l 擴(kuò)增液（ M），在標(biāo)有 WT的管中加入 29 l 擴(kuò)增液（ WT）。2 歡迎下載精品文檔（3）分別向以上 M和 WT各管中加入 1l 反應(yīng)液。將管蓋蓋緊后，渦旋混勻，瞬時(shí)離心待用。C：待檢測(cè) DNA樣本的配制在上述標(biāo)有 M、WT管中分別加入 3l 待測(cè)基因組 DNA，分別再加入 17l ddH2O使終體積為 50 l 。將管蓋蓋緊后，渦旋混勻，瞬時(shí)離心。D： PCR擴(kuò)增將 PCR管放入 PCR儀中，按如下程序擴(kuò)增： 50 2min ；95 5min ； 94 30sec、60 30sec、65 1min （26Cycles ）；65

6、 10min ； 4 Hold 。取出 PCR產(chǎn)物， 28保存。E： 檢測(cè)卡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)從密封袋中取出檢測(cè)卡，將待測(cè)樣本M與 WT管中的 PCR產(chǎn)物分別滴加在檢測(cè)卡對(duì)應(yīng)的樣品墊處，待 25 min 對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀， 20min 后結(jié)果不可靠。F：質(zhì)量控制（1）檢測(cè)結(jié)果中陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)在陽(yáng)性對(duì)照卡檢測(cè)線（T 線）出條帶，陰性對(duì)照應(yīng)在陰性對(duì)照卡檢測(cè)線（ T 線）不出條帶。正常檢測(cè)時(shí)，應(yīng)定期進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照品及陰性對(duì)照品實(shí)驗(yàn)。（2）陽(yáng)性對(duì)照品實(shí)驗(yàn)：取兩個(gè)無(wú)菌0.2ml PCR薄壁管，在 PCR薄壁管管蓋上依次標(biāo)有M、WT，將20l M 陽(yáng)性對(duì)照液、 20l WT 陽(yáng)性對(duì)照液分別加入標(biāo)有M、 WT的 PCR薄壁管

7、中，再依次分別加入M擴(kuò)增液 29l 及 1l 反應(yīng)液、 WT擴(kuò)增液 29l 及 1l 反應(yīng)液，按照步驟中DF完成，檢測(cè)線（ T線）及質(zhì)控線（ C線）均應(yīng)出現(xiàn)條帶。（3）陰性對(duì)照品實(shí)驗(yàn)：取兩個(gè)無(wú)菌 0.2ml PCR薄壁管，在 PCR薄壁管管蓋上依次標(biāo)有 M、WT，將M擴(kuò)增液 29l 、1l 反應(yīng)液及 WT擴(kuò)增液 29l 、1l 反應(yīng)液分別加入標(biāo)有 M、WT的 PCR薄壁管中，再分別加入 20l 陰性對(duì)照液，按照步驟中 DF完成，質(zhì)控線（C線）應(yīng)出現(xiàn)條帶，檢測(cè)線（T 線）應(yīng)無(wú)條帶出現(xiàn)。G：結(jié)果判讀（如下圖、下表）如上圖一所示，以陽(yáng)性對(duì)照液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)線（T

8、線）有條帶出現(xiàn)，作為陽(yáng)性對(duì)照；以陰性對(duì)照液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)線（T。3 歡迎下載精品文檔線）無(wú)條帶出現(xiàn)，為陰性對(duì)照。若陰性樣本有條帶出現(xiàn)，有可能加樣時(shí)未及時(shí)更換吸頭，有DNA污染，建議在操作過程中，先配制陰性對(duì)照管并及時(shí)閉合PCR管蓋。圖二顯示MTHFR 677CC表示正常野生型；圖三顯示 MTHFR677TT表示一對(duì)等位基因的第677 位胞嘧啶（C）均變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），即純合突變；圖四顯示MTHFR677CT表示其中一個(gè)等位基因的第677 位胞嘧啶（ C）變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），即雜合突變；圖五質(zhì)控線（C線）無(wú)條帶或質(zhì)控線（ C 線）與檢測(cè)線（ T 線）均無(wú)條帶

9、，即為無(wú)效檢測(cè)。無(wú)效原因可能為操作不正確或試紙條已變質(zhì)損壞。應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的檢測(cè)卡重新檢測(cè)。如果問題仍然存在，應(yīng)立即停止使用該批號(hào)產(chǎn)品，并與廠家或供應(yīng)商聯(lián)系。圖一 陽(yáng)性及陰性對(duì)照?qǐng)D二 野生型圖三 純合突變圖四 雜合突變圖五 無(wú)效圖H：注意事項(xiàng)（ 1）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該遵循 PCR實(shí)驗(yàn)規(guī)范的要求分區(qū)操作，各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，加模板和引物的移液器不能混用，每次加樣后均需更換吸頭，推薦使用無(wú)核酶、帶濾芯的吸頭。各區(qū)的儀器、設(shè)備和工作服應(yīng)獨(dú)立使用。（ 2）本試劑盒用于體外操作。用戶切勿吸入試劑或直接接觸皮膚。（ 3）使用本試劑盒前，請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書，嚴(yán)格按照說明書的要求操作。打開包裝后請(qǐng)盡快使用。（ 4）使用本試劑盒時(shí)，因 PCR體系為 50l 體系，應(yīng)使用 200l 的 PCR擴(kuò)增管進(jìn)行操作。（ 5）本試劑盒備有 “PCR組分加入確認(rèn)單 ” ，在【檢測(cè)方法】中的步驟 B(PCR擴(kuò)增系統(tǒng)的準(zhǔn)備 ) 和 C(待檢測(cè) DNA樣本的配制 ) 操作過程中應(yīng)在確認(rèn)單中逐一標(biāo)注，以保證“擴(kuò)增液、反應(yīng)液、DNA模板和 ddH