T∕CAIA SH009-2017 食品中沙門氏菌實時熒光核酸恒溫擴增檢測（SAT）方法

1、T/CAIA/SH009-2017T/CAIA中國分析測試協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)T/CAIA/SH009-2017食品中沙門氏菌實時熒光核酸恒溫擴增檢測（SAT）方法Real-Time Simultaneous Amplification and Testing (SAT) method for detecting Salmonella spp in foods2017-07-20 發(fā)布2017-10-01 實施中國分析測試協(xié)會發(fā)布II前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009 規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國分析測試協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)化委員會提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、

2、上海仁度生物科技有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B 為資料性附錄，附錄 C 為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王慧、儲瑞藹、邱紅玲、張常娥、于明輝。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。T/CAIA/SH009-2017食品中沙門氏菌實時熒光 核酸恒溫擴增檢測（SAT）方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中沙門氏菌（Salmonella spp）的SAT 檢驗技術(shù)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于肉類、蛋品、乳制品及其加工食品等食品中的沙門氏菌的檢驗。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本部分。GB 4789.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

3、食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗GB 4789.1食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 總則GB /T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB 19489 實驗室 生物安全通用要求GB/T 27403 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品分子生物學(xué)檢測GB/T 27405 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品微生物檢測3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)恒溫擴增實時熒光檢測技術(shù)（Simultaneous Amplification and Testing，SAT）：指 RNA 恒溫擴增實時熒光檢測技術(shù)。4 SAT 原理在同一溫度下，以細(xì)菌 RNA 為起始模板，通過 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo) RNA 的一個雙鏈

4、 DNA， 然后利用T7 RNA 多聚酶以該 DNA 為模板產(chǎn)生多個（1001000）RNA 拷貝；每個 RNA 拷貝數(shù)再從17反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個擴增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的優(yōu)化探針和這些 RNA 拷貝特異結(jié)合后，打開莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生熒光，根據(jù)實時熒光信號的出現(xiàn)時間和強度，結(jié)合陽性對照和陰性對照即可對檢測結(jié)果進(jìn)行判定。5 材料和設(shè)備除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其它設(shè)備如下：5.1 實時熒光恒溫檢測系統(tǒng)。5.2 臺式離心機。5.3恒溫培養(yǎng)箱：36 1 。5.4振蕩器。5.5 冰箱（28 和-20 或-80 ）。5.6 均質(zhì)器。5.7 電子天平（感量 0.1 g ）。5.8 微量可調(diào)

5、移液器及配套無 DNA/RNA 酶吸頭（10L、100L、1000L）。5.9 無DNA/RNA 酶離心管（0.5 mL、1.5mL、2.0 mL）5.10 水浴槽5.11 恒溫混勻儀5.12 制冰機5.13 干熱恒溫器5.14 分光光度計5.15 比色皿6 試劑除特別說明外，所用試劑均為分析純，水為按照 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。溶解 RNA 所用的水必須為無RNA 酶污染一級水。所用試劑均用無 DNA/RNA 酶污染的容器分裝。6.1 緩沖蛋白胨水（BPW）：見附錄 A 中 A.1。6.2 無菌生理鹽水：見附錄A 中A.2。6.3 沙門氏菌SAT 實驗相關(guān)引物和探針上游引物:擴增沙

6、門氏菌種屬特異性基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA 的上游引物（序列見附錄B 中B. 1.1）。下游引物: 擴增沙門氏菌種屬特異性基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNA 的下游引物，包含 T7 啟動子識別位點（序列見附錄B 中B. 1.1）。沙門氏菌特異性探針：探針的 5端標(biāo)記熒光報告基團 FAM，3端標(biāo)記熒光淬滅基團 DABCYL（序列見附錄 B 中B. 1.1）。內(nèi)質(zhì)控 RNA（IC-RNA），體外轉(zhuǎn)錄成 RNA，加入到每個反應(yīng)體系中（序列見附錄B 中B. 1.1）。內(nèi)質(zhì)控探針：探針的 5端標(biāo)記熒光報告基團HEX, 3端標(biāo)記熒光淬滅基團DABCYL，識別內(nèi)質(zhì)控 RNA上的特定序列（序列見附錄 B 中B. 1.1）。6.

7、4 陽性質(zhì)控品：由有資質(zhì)的權(quán)威機構(gòu)提供沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，-80冰箱保存。（來源和編號見附錄B1.1） 6.5 SAT 反應(yīng)液（成分見附錄 B. 1.1）6.6 SAT 酶液 （含 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、T7 RNA 多聚酶等成分，見附錄 B.1.1）6.7 Trizol 溶液6.8 氯仿6.9 異丙醇6.10 無水乙醇6.11 RNA 提取試劑盒6.12 溶菌酶7 實驗室安全防護(hù)實驗室結(jié)構(gòu)和設(shè)施、安全操作規(guī)程、安全設(shè)備及個體防護(hù)應(yīng)符合 GB 19489 中二級生物安全防護(hù)實驗的要求。 8 檢測流程待測樣品前處理后的樣品、選擇性增菌液、培養(yǎng)后的可疑菌株細(xì)菌RNA提取SAT檢測結(jié)果判定陰性結(jié)果陽性

8、結(jié)果傳統(tǒng)方法確認(rèn)報告結(jié)果9 樣本的采集、保存和運送9.1 樣品采集食品樣品的采集按照GB 4789.1 要求執(zhí)行。9.2 樣本的保存樣品采集后應(yīng)盡早檢測，如需保存，非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置 710冰箱保存，冷凍樣品置于-20冰箱保存。10 實驗室檢測實驗室質(zhì)量控制應(yīng)按 GB/T 27403 和GB/T 27405 進(jìn)行。SAT 檢測質(zhì)量控制見附錄C。10.1 樣品前處理遵行GB 4789.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗中的樣品制備方法，簡述如下：10.1.1 非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置 710冰箱保存，盡可能及早檢驗；冷凍樣品應(yīng)在 45 以下不超過 15 min 或在 25不

9、超過 18 h 解凍。10.1.2 固體樣品以無菌操作取樣品 25 g， 若需要增菌培養(yǎng)，加入 225 mL BPW 肉湯，若不需要增菌培養(yǎng)，則加入 225 mL 無菌生理鹽水。800010000 r/min 均質(zhì) 12 min， 或放入盛有 BPW 肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 12 min，制備成 1:10 的樣品勻液。10.1.3 液體樣品以無菌操作取樣品 25 mL，若需要增菌培養(yǎng)，加入 225 mL BPW 肉湯中，振蕩混勻； 若不需要增菌培養(yǎng)，則直接取樣品進(jìn)行測試。10.2 增菌（可選擇）將上述需要增菌的 1:10 樣品勻液（BPW 肉湯 ）于 361 培養(yǎng) 18 h24

10、 h；不需要增菌的樣品，直接取 1:10 樣品勻液上清液或樣品原液備用。10.3 樣品 RNA 提取10.3.1 樣品處理在樣品制備區(qū)進(jìn)行，為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行實際樣品檢測時，應(yīng)設(shè)立陽性對照、陰性對照試驗；然后提取實際樣品、陽性對照樣品和陰性對照樣品中的 RNA。10.3.2 提取方法Trizol 法提取RNA(1) 取 1 mL 樣品至 1.5 mL 離心管中，10,000 r/min 離心 1min，徹底棄掉培養(yǎng)基，加入 100 L (400 g/mL)溶菌酶，37懸浮細(xì)菌酶解 5-10 min。(2) 立即加入 1 mL Trizol 溶液，蓋緊管蓋，激烈震蕩 15s， 冰上靜

11、置 5min，12,000 r/min 離心 10min， 取上層無色水相轉(zhuǎn)入新的 1.5 mL 離心管中；(3) 每管加入 200 L 的氯仿， 蓋緊管蓋，激烈震蕩 15s,，冰上靜置 5min，12,000 r/min 28離心10min，小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)入新的 1.5mL 離心管，定量；(4) 加入等體積的氯仿蓋緊管蓋，激烈震蕩 15s， 冰上靜置 5min，12,000 r/min 28離心 10min， 小心吸取上層水相，轉(zhuǎn)入新的 1.5mL 離心管。（5） 加入 500 L -20預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻； 12000 r/min 28 離心 10min，小心吸去上清；（6）

12、 加入 500 L -20預(yù)冷的 75%的乙醇（使用無 RNA 酶的滅菌水配制），并輕柔顛倒，洗滌沉淀；12000r/min, 離心 5min,小心吸去上清；微離，吸去剩余乙醇，室溫干燥 5 min;（7） 加入 20L 無 RNA 酶水溶解RNA。（8） 利用分光光度計測定樣品OD260，以 1 個 OD 相當(dāng)于 40mg/L RNA 濃度來計算 RNA 濃度。注：RNA 提取可采用上述方法，也可使用等效的商品化 RNA 提取試劑盒和 RNA 純化磁珠等， 并按其說明提取制備模板RNA。10.4 擴增檢測液配制在PCR 反應(yīng)管中按表 1 依次加入反應(yīng)試劑，混勻。也可采用經(jīng)驗證的、等效的 SA

13、T 檢測反應(yīng)試劑盒， 見附錄 B。表 1 擴增檢測液配制加入試劑成分工作液濃度加樣量/LSAT 反應(yīng)液128 L上游引物10 M0.25 L下游引物10 M0.25 L沙門氏菌特異性探針10 M0.25 L內(nèi)質(zhì)控探針10 M0.25 L內(nèi)質(zhì)控 RNA-0.5 LRNA 樣品-2 L10.5 恒溫擴增檢測10.5.1 設(shè)定熒光檢測儀器反應(yīng)條件為：42 1min，共 40 個循環(huán)，熒光通道設(shè)定為 F1（FAM）和 F2（HEX 或波長相近的其他染料，如：VIC），熒光信號每分鐘收集 1 次，反應(yīng)體系為 40L。10.5.2 將上述擴增檢測液混勻后取 30L 轉(zhuǎn)移至微量反應(yīng)管中，放置在干熱恒溫器上

14、60保溫 10min， 然后42保溫5min?？焖偌尤胩崆邦A(yù)熱至42的SAT 酶液10L（含2000U MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和2000U T7 RNA 多聚酶） 于每個反應(yīng)管中，1200rpm 離心 15s 混勻。10.5.3 將微量反應(yīng)管迅速放置熒光檢測儀器內(nèi)，立即啟動反應(yīng)程序。11 結(jié)果判定11.1 閾值設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點來設(shè)置熒光信號閾值，并扣除儀器噪聲。11.2 對照檢測結(jié)果分析陽性對照出現(xiàn)典型擴增曲線，且 dt 值35，而陰性對照無典型擴增曲線，且熒光信號低于設(shè)定閾值，表明反應(yīng)體系工作正常。否則，重新檢測。 11.3 樣品檢測結(jié)果判定檢測結(jié)束后，在反應(yīng)體系工作

15、正常的前提下，根據(jù)樣品的擴增曲線和 dt 值判定結(jié)果，判定情況說明見表 2。表 2沙門氏菌實時熒光核酸擴增檢測結(jié)果判定情況反應(yīng)類別F1 通道（FAM）F2 通道（HEX 或波長相近的其他染料，如：VIC）結(jié)果判定1+（1） dt 值35，表明 “樣品中檢出沙門氏菌，檢出結(jié)果為陽性”；（2） 若 35dt 值40，應(yīng)重復(fù)實驗，如重復(fù)檢測結(jié)果 dt 值 40，則表明樣品中檢出沙門氏菌，檢出結(jié)果為陽性；如重復(fù)檢測結(jié)果 dt 值40，表明樣品中未檢出沙門氏菌，檢出結(jié)果為陰性。對篩檢結(jié)果為陽性的樣品，對樣品的增菌液或可疑菌落進(jìn)一步按GB 4789.4 中的操作步驟進(jìn)行確認(rèn)后報告結(jié)果。2+dt 無數(shù)值或4

16、0，則表明樣品中未檢出沙門氏菌，檢出結(jié)果為陰性。3反應(yīng)失敗。樣品中可能存在反應(yīng)抑制物，或樣品比較粘稠，油脂含量高等原因影響 RNA 提取，建議將樣品稀釋后重新檢測。11.4 報告根據(jù)表 2 進(jìn)行結(jié)果判定，報告“每 25g（mL）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌”。附錄A培養(yǎng)基和試劑（資料性附錄）A.1 緩沖蛋白胨水（BPW）A.1.1 成分蛋白胨10.0 g氯化鈉5.0 g磷酸氫二鈉（含 12 個結(jié)晶水）9.0 g磷酸二氫鉀1.5 g蒸餾水1 000 mLpH 7.20.2A.1.2 制法將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約 10 min，煮沸溶解，調(diào)節(jié) pH，高壓滅菌 121 ，15 min。A

17、.2 生理鹽水A.2.1 成分氯化鈉8.5 g蒸餾水1 000.0 mLA.2.2 制法稱取 8.5g 氯化鈉溶于 1000mL 蒸餾水中，121 高壓滅菌 15 min。附錄 B(資料性附錄)食品中沙門氏菌實時熒光核酸擴增檢測試劑盒(Sal.spp.-SAT)的組成、使用方法和注意事項 檢測試劑盒組成及分類由指定單位提供，僅供參考，使用時，可根據(jù)所使用產(chǎn)品說明進(jìn)行操作。 B. 1 試劑盒組成 試劑盒有試劑A 和試劑 B 組成，用于樣本的提取及擴增檢測。試劑A組成成分主要成分裂解液去垢劑核酸提取液捕獲探針和磁性顆粒洗滌液SDS試劑B組成成分主要成分反應(yīng)液dNTPs、NTPsSAT 酶液反轉(zhuǎn)錄酶

18、，T7 聚合酶檢測液引物、熒光探針陽性對照Sal.spp. RNA內(nèi)標(biāo)Sal.spp. IC RNA陰性對照生理鹽水B. 1.1 試劑盒各成分的組成沙門氏菌 SAT 實驗相關(guān)引物探針序列：上游引物: 5-GGGAGAAGGCACGCTGAC-3。下游引物: 5 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAGCCAGCTGGTATCTTCGACTGACTT CAG-3沙門氏菌特異性探針：5-CCGAGAAGUGAUUUACUCGG-3，5端標(biāo)記熒光報告基團 FAM，3端標(biāo)記熒光淬滅基團DABCYL。內(nèi)質(zhì)控探針：5-CGCUGGAGCGUGGUGAGCAGCG-3，5端標(biāo)記熒光報告基

19、團 HEX, 3端標(biāo)記熒光淬滅基團DABCYL，識別內(nèi)質(zhì)控 RNA 上的特定序列。內(nèi)質(zhì)控 RNA（Sal.spp.IC-RNA）：5-UCAGGUAACACGAAAUCGUACCCCAAACCGACACAGGUGGUCAGGUAGAGAAUACCAAG GCGCUUGAGAGAACUCGGGUGAAGGAACUAGGCAAAAUGGUGCCGUAACUUCGGGAGAAG GCACGCUGACACGUAGGUUGGAGCGUGGUGAGCUGGAGCUGAAGUCAGUCGAAGAUACCA GCUGGCUGCAACUGUUUAUUAAAAACACAGCACUGUGCAAACACGAAAGUG

20、GACGUAUACG GUGUGACGCCUGCCCGGUGCCGGAAGGUUAAUUGAUGGGGUCAGCGUAAGCGAAGCUCC U GAUCGAAGCCCCGGUAAACGGCGGCCGUAACUAUAACGGUCCUAAGGU-3裂解液：50 mM Tris (pH7.0)， 0. 1% (V/V) SDS，1% (V/V) Triton X-100，0.1%(V/V) NP-40。核酸提取液：HEPES 50400mM， EDTA 40200mM， LiCl 4002000mM，0.25uM 捕獲探針和 250mg/mL 磁珠。洗滌液：HEPES 550mM， NaCl 15

21、0mM， 1%SDS，EDTA 1-10mM。反應(yīng)液：Tris 25mM， MgCl2 10 mM， dNTPs 1mM，NTPs 5mM，5%(v/v)丙三醇的溶液。檢測液：含有 0.27 M 上游引物，0.27 M 下游引物，0.18 M 單鏈靶核酸檢測探針和 0.18 M單鏈內(nèi)標(biāo)檢測探針。SAT酶液：含有2000U M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、2000U T7 RNA 聚合酶，20mM Tris，0.1 (V/V)TritonX-100，30mM KCl，0.01mM EDTA，0.1mM DTT，50 (V/V) 丙三醇。內(nèi)標(biāo)：含有核酸序列的體外轉(zhuǎn)錄RNA稀釋物，濃度為510 7copies

22、/mL。陽性對照：含有沙門氏菌23S rRNA 部分基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA 稀釋物，濃度為110 7copies/mL。陰性對照：為生理鹽水和裂解液1 1 混合的溶液。陽性質(zhì)控品：，沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株編號：CMCC(B) 50115。B.2 試劑盒使用方法B.2.1 樣品制備遵行GB 4789.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗中的樣品制備方法，簡述如下：B.2.1.1 非冷凍樣品采集后應(yīng)立即置 710冰箱保存，盡可能及早檢驗；冷凍樣品應(yīng)在 45 以下不超過 15 min 或在 25不超過 18 h 解凍。B.2.1.2 固體樣品以無菌操作取樣品 25 g， 若需要增菌培養(yǎng)，加入

23、225 mL BPW 肉湯，若不需要增菌培養(yǎng)，則加入 225 mL 無菌生理鹽水。800010000 r/min 均質(zhì) 12 min， 或放入盛有 BPW 肉湯的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打 12 min，制備成 1:10 的樣品勻液。B.2.1.3 液體樣品以無菌操作取樣品 25 mL，若需要增菌培養(yǎng)，加入 225 mL BPW 肉湯中，振蕩混勻； 若不需要增菌培養(yǎng)，則直接取樣品進(jìn)行測試。B.2.2 增菌（可選擇）將上述需要增菌的 1:10 樣品勻液（BPW 肉湯 ）于 361 培養(yǎng) 18 h24 h；不需要增菌的樣品，直接取 1:10 樣品勻液上清液或樣品原液備用。B.2.3 樣品 R

24、NA 提取B.2.3.1 樣品處理在樣品制備區(qū)進(jìn)行，為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行實際樣品檢測時，應(yīng)設(shè)立陽性對照、陰性對照試驗。與樣品一起同時提取對照試驗中 RNA，RNA 提取體系見表 1。從 Sal.spp.-SAT 提取試劑A、 SAT 檢測試劑 B（參見附錄 B）中取出相應(yīng)試劑，放置常溫，充分混勻，按照試劑盒的說明書加入相應(yīng)試劑和待測樣品。樣品處理步驟：分別加入表 B 1 中所列的 200 L 樣品、陰陽性對照至核酸提取液管中（離心管或深孔板）每管中依次加入，200 L 裂解液、100 L 核酸提取液、10 L 內(nèi)標(biāo)，60保溫 5min，然后室溫放置 10min。表 B 1Sal.sp

25、p.-SAT 提取體系加入試劑成分制備方法每個反應(yīng)管中加入體積內(nèi)標(biāo)取 0.4mL 裂解液，加入 10L 內(nèi)標(biāo)，混勻備用。10L核酸提取液使用前混勻100L裂解液直接使用200L檢測樣本A、 陽性對照：取 0.2mL 生理鹽水，加入 10L200L陽性對照品，混勻備用。B、陰性對照：取 0.2mL 生理鹽水，加入 10L陰性對照品，混勻備用。C、食品樣本：增菌后培養(yǎng)液或 1:10 生理鹽水稀釋液，或樣品原液。洗滌液直接使用每次 700L(儀器提取)、1mL（手工提取）擴增檢測液（擴增體系用于磁珠洗脫，后期直接帶著磁珠進(jìn)行反應(yīng)）按照 40 L 反應(yīng)液+2.5 L 檢測液比例直接混合， 振蕩混勻，3

26、000rpm 離心 10s 備用。40LB.2.3.2 提取方法B.2.3.2.1 儀器提取樣品處理過程中，將樣品及試劑加入到 96 孔深孔板中，同時將對應(yīng)的孔中加入 700L 洗滌液（2 次以上洗滌），每個檢測液孔中加入 40L 擴增檢測液。按照磁珠吸附核酸第 1 次洗滌第 2 次洗滌釋放磁珠至擴增檢測液中的步驟，設(shè)置好儀器程序，進(jìn)行提取。B.2.3.2.2 手工提取將樣品處理管（離心管）放置于磁力架上，靜止 5min，待磁珠吸附于管壁后，用移液器吸干管蓋和管中的氣泡和液體，保留磁珠；加入洗滌液 2 次，每次加入 1mL 洗滌震蕩后，重復(fù)前面操作；將樣品管移離磁力架，每管中加入 40L 擴增

27、檢測液，震蕩混勻，完成提取過程。B.2.4 恒溫擴增檢測B.2.4.1 設(shè)定熒光檢測儀器反應(yīng)條件為：42 1min，共 40 個循環(huán)，熒光通道設(shè)定為 F1（FAM）和F2（HEX 或波長相近的其他染料，如：VIC），熒光信號每分鐘收集 1 次，反應(yīng)體系為 40L。B.2.4.2 移取 30L 上述提取后擴增檢測液轉(zhuǎn)移至微量反應(yīng)管中，放置在干熱恒溫器上 60保溫 10min， 然后 42保溫 5min。快速加入提前預(yù)熱至 42的SAT 酶液 10L 于每個反應(yīng)管中，1200r/min 離心 15s 混勻。B.2.4.3 將微量反應(yīng)管迅速放置熒光檢測儀器內(nèi)，立即啟動反應(yīng)程序。B.2.5 結(jié)果判定B

28、.2.5.1 閾值設(shè)定以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點為熒光信號閾值，并扣除儀器噪聲。B.2.5.2 對照檢測結(jié)果分析陽性對照出現(xiàn)典型擴增曲線，且 dt 值35，而陰性對照無典型擴增曲線，且熒光信號低于設(shè)定閾值，表明反應(yīng)體系工作正常。否則，重新檢測。 B.2.5.3 樣品檢測結(jié)果判定檢測結(jié)束后，在反應(yīng)體系工作正常的前提下，根據(jù)樣品的擴增曲線和 dt 值判定結(jié)果，判定情況說明見表 B 2。表 B 2沙門氏菌實時熒光核酸擴增檢測結(jié)果判定情況反應(yīng)類別F1 通道（FAM）F2 通道（HEX 或波長相近的其他染料， 如：VIC）結(jié)果判定1+（1） dt 值35，表明“樣品中檢出沙門氏菌，檢出結(jié)果為陽性”；（2） 若 35dt 值40，應(yīng)重復(fù)實驗，如重復(fù)檢測結(jié)果 dt 值 40，則表明樣品中檢出沙門氏菌，檢出結(jié)果為陽性；如重復(fù)檢測結(jié)果 dt 值40，表明樣品中未檢出沙門氏菌，檢出結(jié)果為陰性。對篩檢結(jié)果為陽性的樣品，對樣品的增菌液或可疑菌落進(jìn)一步按GB 4789.4 中的操作步驟進(jìn)行確認(rèn)后報告結(jié)果。2+dt 無數(shù)值或40，則表明樣品中未檢出沙門氏菌，檢出結(jié)果為陰性。3反應(yīng)失敗。樣品中可能存在反應(yīng)抑制物，或樣品比較粘稠，油脂含量高等原因影響 RNA 提取，建議將樣品稀釋后重新檢測。B.2.5.4