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1、溫 州 醫(yī) 學(xué) 院 檢 驗(yàn) 醫(yī) 學(xué) 院溫 州 醫(yī) 學(xué) 院 檢 驗(yàn) 醫(yī) 學(xué) 院溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科陶志華陶志華分子雜交定量分析技術(shù)(一一)分支鏈分支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)信號(hào)放大技術(shù) (bDNA)美國(guó)Chiron公司, 分別以微反應(yīng)板和瓊脂糖珠為載體,在定量檢測(cè)系統(tǒng)中,采用了一種人工合成的、結(jié)構(gòu)如同樹(shù)枝的DNA信號(hào)放大探針,分支鏈DNA(branched DNA)因此而得名。 (二)(二) 雙抗體夾心雜交法雙抗體夾心雜交法 英國(guó)Murex Diagnostics Ltd發(fā)明, 稱之為Digene系統(tǒng)。 該技術(shù)采用兩種抗DNA/RNA雜交體的抗體:一抗為捕獲抗體,

2、直接吸附在微孔反應(yīng)板上,二抗是偶聯(lián)了AP的標(biāo)記抗體,通過(guò)酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)DNA/RNA雜交體的信號(hào)。真正的核酸探針是RNA,它能特異地與HBV DNA基因組負(fù)鏈互補(bǔ)。 (一)(一)PCR基因定量基礎(chǔ)基因定量基礎(chǔ)Yn=Yn-1*(1+Ev) 0 1Yn=X*(1+Ev)n LgY=LgX + n Lg(1+E)LgX = LgY - n Lg(1+E) 怎么辦?怎么辦? YS n=XS*(1+ES)n YI n=XI *(1+EI)n YS n XS YI n XI ELISA-PCR技術(shù)技術(shù)Fam(495nm) Tamra(560nm) L640 Tet (520nm) Hex(537nm

3、) L705 Tamra/Fam Tamra/Tet Tamra/Hex 熒光定量熒光定量PCR技術(shù)技術(shù)熒光標(biāo)記信號(hào)的產(chǎn)生熒光標(biāo)記信號(hào)的產(chǎn)生特異性熒光探針特異性熒光探針 TaqmanTaqman雙熒光標(biāo)記探針雙熒光標(biāo)記探針 molecular Beaconmolecular Beacon熒光標(biāo)記探針熒光標(biāo)記探針 熒光標(biāo)記雜交雙探針熒光標(biāo)記雜交雙探針特異性熒光雙標(biāo)記探針特異性熒光雙標(biāo)記探針 Taq酶酶 5353外切酶活性外切酶活性lecu三. 熒光實(shí)時(shí)定量PCR的定量原理: Y=X(1+E)nLgY=LgX + n Lg(1+E)LgX = LgY - n Lg(1+E) n = LgY/ Lg

4、(1+E) 1/ Lg(1+E) LgX 熒光實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)PCR的定量概念的定量概念 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線未知標(biāo)本未知標(biāo)本Crossing Point (Cycles)log (copy number)nlog (F2/F1)nlog (F2/F1)Target在對(duì)數(shù)期進(jìn)行定量分析的優(yōu)勢(shì)在對(duì)數(shù)期進(jìn)行定量分析的優(yōu)勢(shì)l 擴(kuò)增效率恒定擴(kuò)增效率恒定 l 動(dòng)態(tài)分析,變化靈敏動(dòng)態(tài)分析,變化靈敏l 標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性核酸定量檢測(cè)臨床應(yīng)用核酸定量檢測(cè)臨床應(yīng)用 免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng),應(yīng)用于臨床通常在免疫學(xué)診斷主要是抗原抗體反應(yīng),應(yīng)用于臨床通常在體內(nèi)產(chǎn)生抗體以后,而許多病原體的免疫學(xué)檢測(cè)存在體內(nèi)產(chǎn)生

5、抗體以后,而許多病原體的免疫學(xué)檢測(cè)存在較長(zhǎng)的較長(zhǎng)的“窗口期窗口期”,比如,比如HCVHCV的的“窗口期窗口期”平均長(zhǎng)達(dá)平均長(zhǎng)達(dá)7070天,不利于對(duì)疾病的早期診斷;天,不利于對(duì)疾病的早期診斷;PCRPCR方法直接檢測(cè)病原方法直接檢測(cè)病原體的體的DNA/RNADNA/RNA,能大大縮短,能大大縮短“窗口期窗口期”,其高靈敏度的,其高靈敏度的檢測(cè)顯然也有利于疾病的早期診斷檢測(cè)顯然也有利于疾病的早期診斷。 熒光PCR可實(shí)現(xiàn)對(duì)點(diǎn)突變、缺失突變、插入突變、多基因突變等的檢測(cè),對(duì)產(chǎn)前診斷具有其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì),有利于優(yōu)生優(yōu)育,提高人口素質(zhì)。 熒光PCR可對(duì)病原體的母嬰傳播進(jìn)行有效的監(jiān)控,為確定宮內(nèi)感染、圍產(chǎn)期感染或哺乳期感染等提供依據(jù),為母嬰傳播的阻斷等提供參考。 可對(duì)原癌基因的突變和

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